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雌激素受体阳性(estrogen receptor positive,ER+)的乳腺癌常用治疗法是内分泌治疗,但近来发现越来越多的患者对内分泌药物出现耐药性,因此分子靶向药物研究更加值得关注。大量研究发现,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)与肿瘤细胞凋亡密切相关,针对ERS的药物已成为潜在的抗肿瘤药物,但关于ERS在乳腺癌中的研究还相对较少。葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein94,Grp94)是ERS的标志分子,已有文献报道Grp94在乳腺癌等多种癌细胞异常高表达,其表达水平与肿瘤的发生发展及不良预后均有关系。因此,本实验选择研究Grp94沉默与ERS介导的凋亡在ER+的乳腺癌细胞MCF-7中的关系,并探索相关分子机制,为Grp94应用于ERS介导的乳腺癌治疗提供了理论依据与新的思路。在对Grp94进行研究的同时,我们发现有一个micro RNA基因位于Grp94基因5’外显子,名为miR-3652(micro RNA-3652)。我们也对miR-3652进行了相关研究,通过过表达miR-3652,研究其对MCF-7细胞生物学特性的影响。第一部分Grp94干扰后通过内质网应激诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制研究目的:研究人乳腺癌MCF-7细胞中Grp94干扰与ERS介导的凋亡的关系并探索相关的分子机制。方法:用衣霉素(tunicamycin,Tm)处理MCF-7细胞,建立ERS体外模型。在ERS状态下,设计、合成靶向Grp94的si RNA,通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测干扰Grp94对细胞凋亡的影响,并由Western Blotting检测ERS标志物及未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)相关通路分子的表达。结果:在ERS状态下,Grp94被干扰后,FCM显示细胞凋亡率上升;Western Blotting显示Bip、IRE1、p-JNK表达增加,Bcl-2水平降低。结论:Grp94干扰后,细胞应激状态加剧,凋亡增多,且促凋亡效应可能是通过IRE1-JNK-Bcl-2途径来实现的。第二部分过表达miR-3652对人乳腺癌MCF-7细胞生物学特性的影响目的:研究人乳腺癌MCF-7细胞中过表达miR-3652对其生物学特性的影响。方法:在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231及SK-BR-3中检测miR-3652的表达情况,选定适合后续研究的细胞。通过Real-time PCR在m RNA水平检测miR-3652在Grp94被敲降后的表达变化,明确它们在转录水平之间的联系。设计并合成miR-3652模拟物(miR-3652mimics),转染MCF-7细胞,验证过表达效率。通过FCM检测过表达miR-3652对细胞周期及凋亡的影响;通过MTT检测转染后细胞增殖能力的变化。结果:miR-3652在MCF-7细胞中表达水平最低。Grp94被si RNA敲降后,miR-3652表达也同样下降,且差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-3652 mimics可明显增加细胞内miR-3652的m RNA水平。过表达miR-3652对MCF-7细胞的周期、凋亡无明显影响,但在48h后能显著促进细胞的增殖(P<0.05)。结论:miR-3652与宿主基因Grp94表达一致,初步证明它们属于同一转录单元,且miR-3652受宿主基因Grp94的启动子调控。过表达miR-3652对MCF-7细胞的周期、凋亡无明显影响,但对细胞的增殖能力具有促进作用。