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研究背景心肌缺血再灌注(ischaemia/reperfusion, I/R)损伤,是指心脏冠状动脉被阻断一定时间后,恢复血流再灌注的缺血心肌出现结构和功能的损伤,导致梗死范围进一步扩大,心脏功能进一步损害。I/R损伤是冠心病领域多年来研究的重点与热点。研究已经证实,氧化应激是导致心肌缺血/再灌注后心肌损伤的重要原因。目前心肌缺血再灌注损伤的主要保护措施包括：缺血预处理、缺血后处理、药物激活补救激酶途径以及应用自由基清除剂等药物,然而这些治疗并不能有效阻止心肌细胞的缺血再灌注损伤。因此,发现新的心肌保护措施是临床上的重要课题,具有极为重要的公共卫生及社会意义。ALDH2乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2, ALDH2)是已发现的ALDH家族19个成员中对醛类代谢能力最强的同工酶,主要定位于心脏、肺脏、大脑和肝脏的细胞线粒体内,而且它还是体内重要的氧化应激因子,除了能催化乙醛代谢为乙酸外,还能催化其他具有毒性的活性醛类如4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4HNE)、丙二醛等代谢为相应的无毒性的酸。研究证实过表达ALDH2或者增加其活性可以有效的促进毒性醛的代谢、抑制线粒体的损伤以及心肌细胞凋亡。以上研究均提示ALDH2可能为心肌保护新靶点。细胞自噬(autophagy)是在细胞进化过程中,可以维持其内环境稳定的高度保守的过程,是依赖溶酶体对细胞内的蛋白以及线粒体、内质网等细胞器进行降解的重要途径。线粒体自噬(mitophagy)是一种可以选择性清除受损的线粒体从而维持细胞内环境的稳定的特异性自噬。PINK1/Parkin是线粒体自噬依赖的重要的通路,在调控缺血再灌注损伤的过程中发挥着重要作用。已有大量的研究表明,自噬及线粒体自噬是把双刃剑,适度的自噬可以促进细胞生存,然而过度的自噬则可诱导细胞死亡, ALDH2则可以对自噬进行双向调控,从而发挥对心肌的保护作用。本课题旨在从线粒体自噬的调控方面对ALDH2发挥抵抗缺血再灌注损伤保护心肌的具体机制进行系统的研究。目的1.氧化应激损伤在缺血再灌注诱导的PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬通路激活过程中的作用和机制；2. ALDH2 对 PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬通路激活的调控和机制；3. ALDH2对缺血再灌注诱导的心肌损伤的调控和机制。研究方法一、体内1.建立大鼠缺血再灌注动物模型首先将雄性Wistar大鼠随机分为为假手术组(SHAM)、缺血再灌注组(I/R)、Alda-1干预组(I/R+Alda-1)和Daidzin干预组(I/R+Daidzin)、每组12只。然后将大鼠进行麻醉、气管插管、呼吸机辅助呼吸,并且在结扎左冠状动脉前降支前5min,对I/R+Alda-1和1 I/R+Daidzin组的大鼠心肌注射10mg/kg Alda-1及100mg/kg Davidson。在此之后结扎前降支,造成心肌缺血,缺血30 min后再将活结打开,血流再灌注120min。SHAM组大鼠除了不结扎前降支之外,其余的过程均与I/R组相同。2.TTC染色法测定I/R后大鼠各组的心肌梗死面积。3.TUNEL法检测缺I/R后大鼠的各组心肌凋亡水平。4. ALDH2活性测定：提取I/R后大鼠的心肌细胞线粒体蛋白与ALDH2底物乙醛或丙醛反应。5.蛋白印迹法(Western blot, WB):各组大鼠刺激后处死收集心肌细胞,提取心肌细胞总蛋白及线粒体蛋白,分别检钡IJPINK1、Parkin、COX IV、ALDH2、4HNE和β-actin等蛋白的表达水平。二、体外1.建立H9C2心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)模型首先将H9C2心肌细胞分为对照组(CON)、缺氧复氧组(H/R)、Alda-1刺激组(H/R+Alda-1)、Daidzin刺激组(H/R+Daidzin)。CCCP实验组分为缺氧复氧组(H/R)、Alda-1刺激组(]/R+Alda-1)、CCC P刺激组(H/R+CCCP)、CCCP联合Alda-1刺激组(H/R+CCCP+Alda-1)。然后在缺氧／复氧前给予Alda-120umol/L、Daidzin 60umol/L、CCCP 10umol/L、Alda-1 20umol/L+CCCP 10umol/L处理,将其放置于细胞培养箱30min (37℃,95% 02/5% CO2),之后再放入乏氧箱进行缺氧120min(37℃,1% O2/5% CO2/94% N2),最后再放置于细胞培养箱予以复氧60min(37℃,95% O2/5% CO2)。2.DCFH-DA法测定H9C2心肌细胞H/R各组活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平。3.线粒体超氧阴离子探针法测定H9C2心肌细胞H/R后各组线粒体超氧阴离子的水平。4.JC-1法测定H9C2心肌细胞H/R后各组线粒体的电势。5. TUNEL法测定H9C2心肌细胞H/R后各组凋亡的水平。6. ALDH2的活性测定：提取H/R后各组H9C2心肌细胞线粒体蛋白与ALDH2底物乙醛或丙醛反应。7.CCK-8法检测H/R后各组H9C2心肌细胞的活力。8.WB法检测H9C2心肌细胞H/R后各组ALDH2蛋白、4HNE蛋白及线粒体自噬相关通路蛋白PINK1、Parkin的表达。9.细胞免疫荧光法检测H9C2心肌细胞H/R后各组线粒体自噬相关通路蛋白PINK1、Parkin与线粒体标记蛋白COX IV的共定位程度。结果一、ALDH2减少I/R大鼠心肌梗死面积及凋亡TTC染色法显示,与I/R组相比,I/R+Alda-1组心肌梗死面积明显减少,而I/R+Daidzin心肌梗死面积明显增加,差异性显著。TUNE法检测凋亡发现,I/R+Alda-1组的心肌细胞凋亡率明显少于I/R的凋亡率,差异性显著；而I/R+Daidzinn组与I/R组相比,心肌细胞凋亡率有增加趋势。二、ALDH2抑制I/R大鼠心肌细胞的4HNE聚集及线粒体自噬ALDH2检测活性发现,与SHAM组相比,其余三组的ALDH2活性均明显下降,I/R+Alda-1组的ALDH2活性明显高于I/R组,差异显著,而I/R+Daidzin组的ALDH2活性有进一步下降的趋势。四组之间的ALDH2蛋白表达结果却无明显差异。Western blot检测线粒体自噬相关蛋白发现,与SHAM组相比,I/R明显上调PINK1和Parkin蛋白表达,而I/R+Alda-1明显下调I/R诱导的PINK1和Parkin蛋白表达。4HNE蛋白聚集的检测结果与线粒体自噬通路蛋白表达趋势一致。三.ALDH2抑制H/R诱导的H9C2心肌细胞氧化应激及凋亡活性氧与线粒体超氧化物检测发现H/R促进H9C2心肌细胞内ROS含量的增加,ALDH2激活减轻H/R诱导的ROS水平的升高,抑制ALDH2活性促进H/R诱导的MitoSOX含量的增加,但对ROS水平无明显影响。线粒体电势检测结果显示,与CON组相比,其余三组的线粒体电势均明显下降,ALDH2激活和抑制分别抑制和促进线粒体电势下降。TUNEL结果也发现ALDH2激活减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡,而ALDH2抑制对凋亡程度无明显影响。四.ALDH2抑制H/R诱导的H9C2心肌细胞的4HNE聚集ALDH2活性检测显示,H/R参与刺激的三组ALDH2活性均明显下降,Alda-1组的活性明显高于I/R组,具有显著性差异,Daidzin组活性有进一步下降的趋势。而四组之间的ALDH2蛋白表达却无明显差异。细胞活力检测发现,H/R抑制心肌细胞的活力,激活ALDH2减轻H/R诱导的细胞活力的下降,而抑制ALDH2则进一步促进活力下降,差异性显著。Western blot检测4HNE蛋白的表达示,I/R促进4HNE蛋白表达,激活ALDH2抑制I／R诱导的4HNE表达,而抑制ALDH2则进一步促进表达。五. ALDH2抑制H/R诱导的H9C2心肌细胞的线粒体自噬细胞免疫荧光结果显示：与CON组相比,其余三组的PINK1、Parkin蛋白与COX IV蛋白共定位的比例均明显升高,激活ALDH2明显抑制共定位比例,而抑制ALDH2活性无明显促进趋势。Western blot结果发现,激活ALDH2明显抑制H/R诱导的PINK1、Parkin蛋白的高表达,而抑制ALDH2活性则无明显促进趋势六.在H/R诱导H9C2心肌细胞模型中,ALDH2抑制Garbonyl cyanidechlorophenylhydrazone (CCCP)诱导的氧化应激及凋亡CCCP刺激实验检测活性氧与线粒体超氧化物阴离子显示,H/R组与H/R+Alda-1组结果与之前结果一致,Alda-1激活ALDH2活性明显抑制H/R诱导的ROS和MitoSox的生成,CCCP明显促进H/R的诱导作用,而加入Alda-1之后减弱了CCCP的促进作用,差异性显著。心肌细胞凋亡的结果与线粒体电势结果一致,Alda-1明显抑制H/R诱导的线粒体电势下降及凋亡,而CCCP则明显促进H/R的诱导作用,而加入Alda-1之后减弱了CCCP的促进作用,差异性显著。七.在H/R诱导H9C2心肌细胞模型中,ALDH2抑制CCCP诱导的4HNE聚集H/R组与H/R+Alda-1组的ALDH2活性与细胞活力检测结果与之前结果一致,CCCP明显促进H/R对ALDH2活性与细胞活力的抑制,而ALDH2减弱了这种促进作用,差异性显著,但是四组之间的ALDH2蛋白表达结果无明显差异。Western blot检测心肌细胞4HNE蛋白表达证实H/R促进4HNE蛋白形成,CCCP明显促进H/R诱导4HNE蛋白表达,而ALDH2减弱了这种促进作用,差异性显著。八.在H/R诱导的H9C2心肌细胞模型中,ALDH2抑制CCCP诱导的线粒体自噬通路激活细胞免疫荧光检测共定位结果显示：与H/R组相比,ALDH2抑制PIN1、Parkin蛋白与COX IV蛋白的共定位,CCCP明显促进H/R诱导的共定位作用,而A LDH2则逆转了CCCP这种促进作用,差异性显著。Western blot结果与细胞免疫荧光结果一致,激活ALDH2活性明显抑制H/R诱导的PINK1、Parkin蛋白的表达,CCCP明显促进了H/R诱导的表达进一步升高,而ALDH2则逆转了CCCP这种促进作用,差异性显著。结论1.氧化应激损伤介导了心肌缺血再灌注诱导的PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬通路的激活；2. ALDH2可以调控PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬通路的激活；3. ALDH2激活可以改善心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬通路的过度激活有关。