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多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，简称PPO）酶促褐化是导致马铃薯（Solanum Tuberosum.L）块茎损伤褐化及加工产品口感和色泽不良的重要原因。通过对加工型马铃薯品种不同组织及部位在不同生长期内PPO活性变化规律的研究，使我们有可能针对目的PPO基因进行克隆，构建相应的反义基因植物表达载体，并最终获得抗块茎损伤褐化兼具各种优良特性的马铃薯加工型品种。本研究成果如下：1．采用比色法对“甘农薯1号”、“甘农薯2号”、Shapedy、Snowden和Norvalley 5个加工型马铃薯品种在生长阶段的PPO活性进行了研究。结果表明：叶片、匍匐茎、块茎及花药等组织中PPO活性发生着规律性的变化。其中，叶片PPO活性表现出低—高—低的波动，并于现蕾至块茎膨大期达到高峰[31.12 （0.01 ΔOD.min-1）]；块茎PPO活性呈现高—低—高—低的趋势，在块茎初形成时活性最高，达到60.60（0.01 ΔOD.min-1）；花药PPO活性的变化规律与叶片相同，呈现低-高-低的趋势，并在盛花期达到高峰[129.80 (0.01 ΔOD.min-1)]。另外，在同一生长阶段（6月25日-7月24日），不同组织器官的PPO活性具有一定的差异，其中花药PPO活性 >匍匐茎>花蕾、花瓣 >叶片、块茎，以花药组织PPO活性最高，达68.30 (0.01 ΔOD.min-1)。贮藏待播的块茎芽PPO活性明显高于块茎本身。进一步检测结果表明，即便是同一组织的不同部位PPO活性也呈现较大差异，如块茎外皮薄壁细胞组织PPO活性最高，髓薄壁细胞组织最低。2．对马铃薯试管苗、茎段愈伤组织、块茎及块茎芽在不同温度、不同pH条件下PPO的活性进行了研究，发现pH对马铃薯PPO活性具有明显的影响；在pH 5.0～5.5，块茎芽以及愈伤组织PPO活性最高，分别为94.20及20.40（0.01ΔOD.min-1），而试管苗在培养基pH为8.0时PPO活性最高（19.80（0.01ΔOD.min-1））。不同温度下的不同品种PPO活性不同，“甘农薯1号”、Atlantic试管苗PPO活性在18℃～25℃之间达到高峰，分别为16.80和37.20（0.01ΔOD.min-1）；Shapedy、Snowden试管苗在5℃下PPO活性最高；而检测的贮藏块茎PPO活性均在25℃表现最高。3．研究6种褐化抑制剂Vc、AgNO3、L-半胱氨酸、硼酸、柠檬酸和偏重亚硫酸钠对马铃薯叶片、茎段和块茎PPO活性的抑制效果，发现6种褐化抑制剂对马铃薯茎粗酶液PPO活性的抑制效果明显强于叶片和块茎。但不同抑制剂对块茎和叶片的抑制状况不同，其中L-半胱氨酸，柠檬酸抑制块茎褐化效果优于对叶片的抑制；而Vc、AgNO3、硼酸和偏重亚硫酸钠则表现出对叶片褐化具有更强的抑制作用。通过试验找出了不同褐化抑制剂对不同组织PPO活性的最佳抑制浓度。4．从马铃薯品种“甘农薯1号”试管苗叶片中提取总DNA，根据GenBank中的马铃薯多酚氧化酶基因（POT32）序列，设计合成了2对特异引物，通过PCR获得1840bp和476bp的扩增产物，将扩增产物与PMD-18T载体连接，并转化E.coli DH5α，得到2个重组子PMDPPOqc和PMDPPOty。对其进行基因测序，结果表明，1840bp的扩增产物与GenBank中发表的序列一致，同源性达到98%，476bp的扩增产物正是欲扩增的马铃薯多酚氧化酶基因的同源片段。将2个扩增产物反向连接到表<WP=3>达载体PC3中，通过双酶切鉴定后，定义2个反义基因表达载体为PC3-ASPPOqc、PC3-ASPPOty。采用直接导入法将反义基因植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105，经PCR鉴定证明，此质粒已整合到农杆菌Ti上，证明得到了农杆菌工程菌EHA105+PC3-ASPPOqc和EHA105+PC3-ASPPOty。5．用农杆菌工程菌EHA105+PC3-ASPPOqc和EHA105+PC3-ASPPOty对Atlantic、“甘农薯1号”、“甘单花9号”和Norvalley进行遗传转化，得到叶盘预培养2d，侵染10min，共培养3d出愈率、抗性愈伤组织频率和转化率最好，最高可达86.3%，41.67%和3.1%。茎段预培养3d，侵染8min，共培养3d的出愈率、抗性愈伤组织频率和转化率最高,分别为80.2%和43%和3.05%。微型薯及试管微型薯愈伤组织形成缓慢，但两者侵染时间均以10min为好。其中试管微型薯出愈率、抗性愈伤组织频率和转化率分别为69.7%、52.8%和5.4%。而卡那霉素敏感性实验结果表明，叶盘选取25 mg/LKan、茎段，叶柄选取75 mg/LKan、微型薯和试管微型薯选择50mg/LKan作为选择压最为适宜。6．农杆菌介导的PPO反义基因表达载体转化马铃薯以试管微型薯的转化频率最好，在不同侵染时间、不同共培养时间处理下，其平均转化频率可达5.4%；其次为茎段和叶片的转化效率，平均转化频率分别为3.05%和3.1%；微型薯转化效率最差。7．在供试的4个品种中，目前已获得“甘单花9号”、Norvalley转化苗,” “甘单花9号”、Atlantic抗性愈伤组织。经PCR检测、Southern杂交确定，转化植株呈阳性。进一步检测结果表明，转化植株块茎和抗性愈伤组织PPO活性比对照明显降低。