NK细胞是天然免疫系统中具有抗肿瘤和抗病毒功能的重要效应细胞。在病毒感染早期,NK细胞快速应答杀伤被感染靶细胞。NK细胞发育分化、发挥功能等过程受到多种细胞因子的调控。在诱导小鼠骨髓前体细胞发育分化体系中,SCF、IL-7、FLT31和IL-15被证明具有促进NK细胞发育分化的功能。而体内细胞因子网络更为复杂,能够明确某一细胞因子对NK细胞的作用是十分重要的。关于细胞因子的功能研究一般依赖细胞因子或其受体的基因缺陷小鼠,从中可以了解细胞因子在某些细胞亚群发育及功能上的作用。但是有时因代偿作用,细胞因子信号途径的缺失并不会引起任何变化。对小鼠给予外源细胞因子的补充是另一种研究思路,该方法可以明确当体内某种细胞因子含量升高时,对某细胞亚群的发育及功能的影响。但是通常细胞因子半衰期较短,需连续给药,操作复杂,经济成本高。为此,我们构建了免疫系统人源化小鼠以及人IL-21和鼠IL-28B两种细胞因子过表达载体,通过高压注射的方式将载体导入小鼠肝细胞内,实现体内细胞因子的持续供给。在此基础上,分别研究两种细胞因子对人NK细胞和小鼠NK细胞发育分化的影响。1.过表达hIL-21促进人源化小鼠中NK细胞的发育分化免疫系统人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠中,植入人的造血细胞、淋巴细胞或组织而使其具有人的免疫系统的小鼠模型。经过三十几年的不断改进,人源化小鼠模型已日益完善,但是在已有的人源化小鼠模型中,人NK细胞的重建仍是一大难题。当受者小鼠的自身免疫功能过强时,人源NK细胞难以重建,而当受者小鼠的自身免疫功能进一步缺陷,人NK细胞重建水平只得到微弱提高。当外源给予hIL-15时,往往重建的NK细胞比例超过生理水平,导致细胞组成失调。围绕着如何建立一个具有生理水平NK细胞的理想人源化小鼠模型,我们开展了一系列研究工作,主要结果如下:1)我们采用人外周血单个核细胞转输给T细胞、B细胞缺陷的NOD/SCID小鼠进行人源化免疫系统重建。结果发现,虽然在小鼠各脏器中可以检测到较高比例的人源免疫细胞,但是仅表现为人源免疫细胞的直接植入,而没有由人源造血干细胞的发育分化而来的免疫细胞。2)由于人外周血单个核细胞中造血干细胞的比例较低,由造血干细胞发育分化出免疫细胞的概率较低。为此,我们采用脐带血造血干细胞为供者细胞,转输给NOD/SCID小鼠进行人源化免疫系统重建。结果发现,小鼠各脏器中均重建出较高比例的人源免疫细胞,但是T细胞和NK细胞的重建水平较低,揭示受者小鼠中残存的NK细胞仍是人源化免疫系统重建的障碍。3)为了降低受者鼠NK细胞的影响,我们采用脐带血造血干细胞转输给T细胞、B细胞及NK细胞均缺陷的NOG小鼠。结果表明,与NOD/SCID小鼠相比,免疫系统人源化重建水平显著提高,重建时间缩短。4)为了使NK细胞能够在一个模拟人的环境中发育分化,我们在NOG小鼠中过表达hIL-21并转输脐带血造血干细胞重建人源化免疫系统。结果发现,hIL-21的持续表达显著促进了人源化NK细胞的发育分化,并且其NK细胞比例与生理状况相接近。5)进而对免疫系统人源化小鼠进行组织学检测,发现人源化免疫细胞在免疫器官中广泛分布。通过对CD4和CD8分子的检测及分析,表明人源化T细胞在小鼠胸腺中可以完成阳性选择。以上结果表明,我们在NOG小鼠中成功构建了人源免疫系统,并通过实现hIL-21在小鼠体内的持续性表达,提高了人源化免疫系统的重建,尤其是促进了人NK细胞的发育分化。除此之外,人源化T细胞在小鼠的胸腺内能够完成阳性选择,发育为成熟T细胞到达外周。该人源化小鼠模型将为人NK细胞生物学研究提供一个有力的动物模型。2.IL-28B促进小鼠NK细胞的增殖和成熟Ⅲ型干扰素是新近发现的干扰素家族成员,主要包括IFN-λ1(IL-29),IFN-λ2(IL-28A),IFN-λ3(IL-28B)和IFN-λ4。虽然其下游信号与Ⅰ型干扰素有较大的重叠性,但是在抗病毒感染过程中仍具有特异性。NK细胞是抗病毒感染的主要效应细胞,Ⅲ型干扰素是否具有调控NK细胞的抗病毒功能报道较少,为此我们构建了小鼠IL-28B过表达载体,通过高压注射实现在小鼠体内持续性表达IL-28B,进而研究其在NK细胞发育分化及发挥功能过程中的调控作用。结果如下:1)首先,我们对高压注射pLIVE-IL-28b或空载体pLIVE-vector的野生型小鼠脾脏、肝脏及肺脏NK细胞进行了检测。结果发现,过表达IL-28B系统性地增加了 NK细胞的比例和数目。通过流式细胞术对小鼠NK细胞的增殖能力进行检测,结果表明,IL-28B过表达小鼠的脾脏、肝脏和肺脏NK细胞的增殖能力均显著提高。接着,我们根据NK细胞表面标志CD11b,CD27以及KLRG1对NK细胞的成熟阶段进行划分,并检测不同成熟阶段NK细胞的比例及增殖能力。结果表明,IL-28B过表达小鼠各脏器中终末成熟阶段的NK细胞具有更高的增殖能力。这一部分结果表明,体内过表达IL-28B促进NK细胞增殖和成熟。2)为了探索过表达IL-28B对NK细胞活化状态和功能的影响,我们检测了过表达IL-28B的小鼠脾脏、肝脏及肺脏中NK细胞的表面受体NKG2A/C/E,NKG2D,Ly49CIFH、分泌型分子IFN-y,perforin以及活化性标志CD69的表达情况,与对照组小鼠相比均无显著性差异,说明体内过表达IL-28B不会引起NK细胞的过度活化和功能增强。3)由于IL-28Rα只表达于有限类型的细胞上,NK细胞能否直接接受IL-28B的信号仍存在争议。我们发现,在IL-28B过表达小鼠中肺脏NK细胞增加最为显著,而肺泡巨噬细胞中IL-28Rα的表达水平显著高于NK细胞。为了研究IL-28B是否通过先作用于巨噬细胞进而影响了 NK细胞的增殖能力,我们对IL-28B过表达小鼠采用氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞,进而对小鼠脾脏、肝脏及肺脏中NK细胞的比例及不同发育阶段进行了检测。结果表明,巨噬细胞清除小鼠中,NK细胞比例显著下降,不成熟阶段NK细胞增多而成熟阶段NK细胞减少。说明在小鼠体内,巨噬细胞参与了 IL-28B诱导NK细胞增殖和成熟的过程。4)为了进一步确定巨噬细胞与NK细胞的相互作用,我们在体外实验中用不同浓度的IL-28B对小鼠肺泡巨噬细胞进行刺激,进而将巨噬细胞与CFSE标记的小鼠肺脏NK细胞共孵育,并对NK细胞增殖情况进行检测。结果表明,IL-28B预刺激的肺泡巨噬细胞具有促进NK细胞增殖的能力,并且具有剂量依赖性。为了研究IL-28B刺激的巨噬细胞与NK细胞之间的作用是否依赖细胞间直接接触,transwell实验结果表明,巨噬细胞依然能够显著促进NK细胞的增殖,说明IL-28B通过巨噬细胞促进NK细胞的增殖不依赖细胞间直接接触。5)最后,我们采用鼠肺适应株流感病毒PR8对野生型小鼠进行滴鼻感染,并检测其肺脏IL-28的表达情况。结果表明,流感病毒感染小鼠的肺脏IL-28基因及蛋白水平的表达均显著升高。在流感病毒PR8感染模型中,体内过表达IL-28B组小鼠的生存率显著提高,体重下降速率减缓,病理损伤情况明显减轻,均提示IL-28B对PR8毒株的感染具有保护性作用。在NK细胞缺陷鼠Nfil3-/-小鼠中,过表达IL-28B对流感病毒感染具有一定的保护性作用,但是保护效果与野生型小鼠相比较差。说明当NK细胞缺陷时,IL-28B的保护性功能受损,揭示NK细胞参与了 IL-28B保护流感病毒感染小鼠的过程中。以上结果表明,体内过表达IL-28B可以系统性地促进NK细胞增殖和成熟,而这一过程是巨噬细胞依赖的。在鼠肺适应株流感病毒PR8滴鼻感染小鼠模型中,过表达IL-28B对小鼠具有保护性作用,一方面归因于其自身抗病毒功能,另一方面则由于诱导产生更多成熟的NK细胞,二者协同作用抵御病毒感染。更好地了解IL-28B的生物学特性,对其临床应用具有重要的指导意义。