目的:　　线性质粒作为有别于环状结构质粒的一种特殊质粒分子，已成为近年来基础微生物学研究的热点之一。pBSSB1是目前为止在肠杆菌科中发现的唯一线性质粒，其介导了H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛的单向相变换。经生物信息学分析和预测，该线性质粒上的第17号基因(p17)位于其可能的复制起始点附近，编码一相对分子量约27 kDa的蛋白(P17)，可能具有参与调控线性质粒的复制等作用，然而其确切的生物学功能尚不清楚。本研究旨在通过一系列实验对p17基因进行进一步鉴定，分析其可能的生物学功能。　　方法:　　1.重组蛋白P17-His6的表达及纯化:通过PCR、酶切、酶连构建重组表达载体pET28b(+)-p17。将测序验证的阳性重组质粒pET28b(+)-p17导入表达菌E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白表达，采用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白P17-His6。　　2.兔抗重组蛋白P17-His6多克隆抗体的制备:将纯化的重组蛋白P17-His6与弗式佐剂研磨至完全乳化后免疫新西兰大白兔，制备兔抗P17-His6的抗血清并经纯化后用酶联免疫法测定抗体效价，Western-Blot验证抗原与多克隆抗体反应的特异性。　　3.P17蛋白在细菌不同生长时期的表达特性分析:培养伤寒沙门菌野生株至不同生长时期（OD600分别为0.2、0.5、0.8、1.2和1.6），分别提取其总蛋白，利用Western-Blot，选用DnaK做内参，对P17蛋白在伤寒沙门菌不同生长时期的表达量进行分析。　　4.p17基因缺陷变异株的制备:利用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌p17基因缺陷变异株(△p17)。　　5.p17基因缺陷回补株的制备:将p17基因定向连接质粒pBAD/gⅢ形成重组质粒pBAD/gⅢ-p17，分别将重组质粒pBAD/gⅢ-p17和pBAD/gⅢ空质粒导入p17基因缺陷变异株，构建p17基因的缺陷回补株和空质粒回补对照株。　　6.p17基因高表达株的制备:将p17基因定向连接质粒pB AD/Myc-HisA形成重组质粒pB AD/Myc-HisA-p17，分别将重组质粒和pB AD/Myc-HisA空质粒导入伤寒沙门菌野生株，构建p17基因的高表达株和空质粒对照株。　　7.细胞侵袭实验:将野生株和p17基因缺陷变异株培养OD600至0.4后，加入含有HeLa细胞的24孔板中（MOI为20∶1）。培养90 min后取部分孔进行细胞破膜，收集菌体后涂板，长出的菌落数标记为T0（代表细菌粘附细胞能力）;剩余孔的细胞加入庆大霉素后继续培养90 min后，破膜后涂板，将长出的菌落数标记为T90（代表细菌侵袭能力），细菌的侵袭能力以T90/T0值表示。　　8.动力试验:将野生株、p17基因缺陷变异株、p17基因缺陷回补株、p17高表达株和空质粒对照株培养至对数期，各取2.0μL点样到0.3％的半固体平板，37℃培养一定时间后测量动力圈直径，比较各菌株的动力差异。　　9.生长曲线测定:将野生株、p17基因缺陷变异株、p17缺陷回补株、回补空质粒对照株、p17高表达株及其空质粒对照株在液体LB培养基中培养，每1h测定一次OD600值。同时，将p17基因连接到质粒载体pET28b(+)上分别导入E.coli DH5α和E.coli BL21，并测定这两种变异菌株的生长曲线。　　10.p17基因的缺失对细菌全局基因表达的影响:利用基因芯片技术，分析p17基因缺陷后细菌全局基因转录水平的变化。取伤寒沙门菌野生株及其相应的p17基因缺陷株于普通液体LB中培养4h后提取总RNA，逆转录为cDNA同时互标荧光素，与伤寒沙门菌基因组DNA芯片杂交后扫描，荧光信号数据化处理以比较两菌株的基因表达谱差异。选取部分具有代表性的差异表达基因，利用qRT-PCR分析其在p17基因缺陷株和野生株间的表达差异，以验证芯片结果。　　结果:　　1.重组蛋白P17-His6的表达及纯化:最终测序结果表明成功构建了重组质粒pET28b(+)-p17，成功将重组质粒pET28b(+)-p17导入表达菌E.coliBL21(DE3)，Ni柱亲和层析纯化获得的蛋白用SDS-PAGE检测，结果显示获得了高纯度的重组蛋白P17-His6。　　2.兔抗P17-His6多克隆抗体的制备:获得的多克隆抗体用酶联免疫法测定其抗体效价＞1∶128×103，Western-Blot显示抗原与多克隆抗体反应的特异性良好。　　3.P17蛋白在不同生长时期的表达特性分析:Western-Blot结果显示伤寒沙门菌P17蛋白表达量在迟滞期到对数期过程中不断增高，在对数期表达量最高，对数期过后其表达量逐渐降低。　　4.p17基因缺陷变异株的制备:PCR、酶切验证和测序结果显示重组自杀质粒pGMB151-p17构建成功，重组自杀质粒成功导入伤寒沙门菌野生株，经同源重组后筛选到了p17基因缺陷变异株，其能稳定传代，成功制备了伤寒沙门菌p17基因缺陷变异株。　　5.p17基因缺陷回补株的制备:PCR、酶切验证和测序分析显示成功构建了重组质粒pBAD/gⅢ-p17，将重组质粒和pBAD/gⅢ空质粒分别导入p17基因缺陷变异株，PCR、酶切验证表明p17基因的缺陷回补株和空质粒回补对照株制备成功。　　6.p17基因高表达株的制备:PCR、酶切验证和测序分析显示p17基因成功定向连接质粒pB AD/Myc-HisA，形成重组质粒pB AD/Myc-HisA-p17，将重组质粒和pB AD/Myc-HisA空质粒分别导入伤寒沙门菌野生株，PCR、酶切显示p17基因的高表达株和高表达空质粒对照株构建成功。　　7.细胞侵袭实验:p17基因缺陷菌株的侵袭水平略高于野生株，但是经统计学分析差异无统计学意义，结果表明p17的表达差异对伤寒沙门菌的侵袭力影响作用不明显。　　8.动力试验:p17缺陷株动力明显低于野生株，回补株与空质粒回补对照株相比动力增强，p17基因高表达株的动力高于空质粒高表达株，差异具有统计学意义（P＜0.05）。　　9.生长曲线测定:p17基因缺陷变异株的生长速度明显迟缓于野生株(P＜0.05)，且回补p17之后生长速度有明显改善，另外高表达菌株生长速度明显快于空载体对照株，结果表明p17基因的表达影响伤寒沙门菌的生长。除此之外，携带p17基因的大肠杆菌的生长速度明显快于空载体对照株。　　10.p17基因的缺失对细菌全局基因表达的影响:与野生株相比，p17基因缺陷株中共有334个基因表达发生明显变化，其中57个基因表达上调，134个基因表达下调，主要为代谢、侵袭、鞭毛相关基因。部分差异表达基因经qRT-PCR分析，结果与基因芯片的分析结果一致。　　结论:　　本研究证实了S.Typhi的P17蛋白的存在，成功获得了高纯度的重组蛋白P17-His6，并制备了抗P17多克隆抗体，P17蛋白的表达在迟滞期到对数期过程中不断增高，在对数期表达量最高，对数期过后其表达量逐渐降低。p17基因的表达虽然不影响细菌对上皮细胞的侵袭力，但可以增强伤寒沙门菌的动力，p17基因不仅可以促进伤寒沙门菌的生长，而且在大肠杆菌中也起到促生长作用。基因芯片结果显示p17基因影响细菌代谢、侵袭、鞭毛等相关功能，这为深入研究p17的作用和功能打下了良好的基础。