一、研究背景国内外许多研究已经证明血小板浓缩物被激活后可释放出多种细胞生长因子,如：血小板衍化生长因子AB(PDGF-AB)、内皮细胞生长因子(ECGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、类胰岛素生长因子(IGF)等。这些因子对细胞生长分化和组织修复再生有重要的作用。1984年,Assion最早从人血浆中提取出富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP),1987年,Ferrari等将PRP首先运用于心胸外科,随后由于发现PRP释放出的生长因子可以增强组织修复和再生,广泛应用于整形外科和创伤外科等领域。但由于PRP在制备过程中添加了异种凝血酶和抗凝剂,存在免疫排斥反应和感染性疾病传播的危险,其应用一直存在争议。2000年,法国学者Choukroun等第一次制备提取了新一代血小板浓缩制品即富血小板纤维蛋白(Choukroun’s platlet-rich fibrin,Choukroun’s PRF),其保留了上一代血小板浓缩制品PRP的优点,同时兼具制备过程简单、完全取自于自体血、无需添加任何生物制剂、成骨能力强等特点,制备简单且经济,避免了血液交叉感染的风险以及伦理道德的争议。因此PRF被认为是一种最佳的天然血液凝集物。大量研究表明Choukroun’s PRF在口腔颌面外科、骨科和整形美容科有潜在的临床使用价值,比如其可以缩短创伤组织的愈合时间,促进骨组织的移植重建,加速美容手术后的修复。但目前Choukroun’s PRF的研究还处于初级阶段,还需要进一步的研究和探讨。在临床上,由于创伤、感染、肿瘤、畸形等造成的骨缺损非常常见,但骨组织的修复及再生是十分困难的,近几十年来,随着组织工程技术的发展,生物材料的更新,骨组织工程的发展已经成为骨缺损修复的新思路,是解决大块骨缺损等临床难题的较理想方法。而骨组织工程的种子细胞来源制约了骨组织工程进一步的应用。理想的种子细胞来源应具备：来源丰富,取材方便及对机体损伤小；有较强的增殖及传代能力；取自自体组织,移植后不存在免疫排斥反应；植入体内后能高质量的修复骨缺损,并保持良好的远期观察疗效。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有增殖和多向分化的能力,已经广泛用于研究,但其不容易获取,成骨分化能力有限,成为骨组织工程的种子细胞具有局限性。自Zuk等首次从吸脂术抽取的脂肪组织中分离出脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)以来,体外培养的脂肪干细胞表现出与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有类似的分化能力,在体外诱导分化实验中,加入不同的化学试剂和细胞因子,可以诱导ADSCs分化形成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、内皮细胞和肝细胞等。而且脂肪干细胞具有易获取、可迅速扩增及生长迅速的特点。由于其具有以上优点,近年来对其研究很多,ADSCs是一类具有广阔应用前景的成体干细胞,为组织工程技术提供了良好的细胞来源,但由于其作为成体干细胞仍然存在很多值得进一步研究的问题。但其成骨分化能力有限,制约了其在骨组织工程中的运用。二、研究目的本实验研究是体外培养人脂肪干细胞(ADSCs)后,给予自体富血小板纤维蛋白(Choukroun’s PRF)干预,并与对照组进行对比,观察自体富血小板纤维蛋白(Choukroun’s PRF)对人脂肪干细胞(ADSCs)增殖及成骨分化能力的影响,探讨一种可能增强脂肪干细胞增殖及成骨分化的技术,为骨组织工程的种子细胞提供一种新的技术和思路。三、方法1.实验组织来源：所用脂肪来自于成人腹部脂肪抽脂术和骨科大腿手术获得的脂肪组织,供体共8位,为20～40岁患者,为2位珠江医院整形外科和6位骨科的就诊患者,无传染病及内分泌疾病,无长期服用药物史。静脉血来自相应脂肪来源的对应患者。2.体外培养人脂肪干细胞,实验所用的细胞为第3代细胞。3.人脂肪干细胞的鉴定：分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。4.采用Choukroun法制备富血小板纤维蛋白(PRF)。5.实验分组：本实验将普通细胞培养基中加入PRF与否,分为PRF组Ⅰ和对照组Ⅰ,并选择4个时间点(1d、3d、5d、7d)分别对比观察两组细胞增殖情况；成骨诱导培养基中加入PRF与否,分为PRF组Ⅱ和对照组Ⅱ,同样选择4个时间点(7d、14d、21d、28d),对比观察各时间点脂肪干细胞成骨诱导情况,并以不含PRF的普通细胞培养基组作为空白对照。每组样本量3-4例。6.CCK-8比色法制作标准曲线,检验测得的OD值与人脂肪干细胞数量之间的相关性。7.CCK-8试剂盒测定PRF对ADSCs体外增殖的影响。8.检测碱性磷酸酶活性(ALP活性)判断两组脂肪干细胞成骨诱导水平。9. Von Kossa染色法观察成骨诱导各组中细胞钙结节形成情况。10.数据处理及统计学分析方法：用SPSS13.0进行统计学分析。数据用x±s表示。比较采用两独立样本t检验的方法,P<0.05为有统计学意义的标准。四、结果1.人ADSCs形态学观察：原代ADSCs培养8小时后即开始贴壁,贴壁细胞呈集落状生长,呈典型梭形细胞。传代后细胞生长速度较原代明显增快。第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形、多角形或者三角形。2.人ADSCs的鉴定结果：人ADSCs成骨诱导第14天行von Kossa染色黑色钙结节；成脂诱导第14天行油红O染色可见细胞内有鲜红色透亮脂滴形成；成神经球细胞第7天行nestin免疫荧光抗体检测,可见典型的红色荧光球形成。ADSCs表面抗原CD29、CD90、CD45流式检测鉴定,阳性细胞率分别为93.8%、99.3%和0.4%。3.CCK-8比色法制作ADSCs生长标准曲线,其决定系数R2=0.986,回归方程为Y=-2955.56+20809.46X(Y为脂肪干细胞数,X为测得的OD值)。对方程进行检验显示F=347.65,P<0.001,该方程具有统计学意义。CCK-8比色法测得的OD值可以很好的反应实际细胞数量。4.CCK-8检测细胞增殖结果：倒置显微镜观察,PRP组Ⅰ细胞增殖较对照组Ⅰ明显加速生长,其形态与对照组Ⅰ无明显差异。CCK-8检测,PRF组Ⅰ和对照组Ⅰ的OD值均逐渐增大,但各时间点PRF组Ⅰ的OD值均大于对照组Ⅰ,检验后,在第1天,第3天和第5天PRFI组和对照组Ⅰ的吸光度值无显著性差异(P>0.05)；在第7天PRF Ⅰ组的吸光度值高于对照组Ⅰ,经过统计学分析存在显著性差异(P<0.05)。5.ALP活性检测PRF组Ⅱ和对照组Ⅱ的成骨诱导结果：ALP活性检测示PRF组Ⅱ第7、14、21、28天细胞活性较对照组Ⅱ均大,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。6. Von Kossa染色观察两组成骨诱导的钙结节形成结果：PRF组Ⅱ细胞经成骨诱导第7天时,von Kossa染色见黑色钙结节,呈阳性,第14天时染色黑色钙结节明显增多。对照组Ⅱ诱导第7天未见钙结节,第14天见少量阳性钙结节,空白组培养第14天未见黑色钙结节。五、结论脂肪干细胞近年来在许多研究方面取得了进展,证实为一种良好的组织工程种子细胞。本研究就Choukroun’s PRF对脂肪干细胞的增殖及成骨诱导的影响做了初步的体外实验研究,证实其有促进脂肪干细胞增殖及成骨分化的作用,为脂肪干细胞做为骨组织工程的种子细胞提供了一条更有发展的思路,Choukroun’s PRF与脂肪干细胞共同培养有较大的研究价值,目前国内外的研究都还处于起步阶段,还值得进一步研究。