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目的:有研究证实,Wnt/β-catenin通路的激活,与胰腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关;细胞核内β-catenin水平与β-catenin通路活性呈正相关;FH535是β-catenin通路的抑制剂。本研究拟探讨FH535对胰腺癌移植瘤生长和血管生成的影响及其分子机制;并用临床资料和Meta分析,评估WNT/β-catenin通路的激活与胰腺癌预后的关系。为将FH535进一步应用于胰腺癌的治疗提供理论基础。方法:1、应用m RNA芯片(Microarray)检测FH535处理组和对照组基因的表达情况,并用聚类分析技术分析FH535处理组和对照组之间基因表达的差异。2、应用生物信息学分析β-catenin染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation sequencing,Ch IP-Seq)数据,预测β-catenin通路的靶基因。3、应用基因本体(Gene Ontology,GO)分析,预测FH535处理组和对照组之间差异表达基因的生物学功能和β-catenin通路靶基因的生物学功能。4、应用Real-time PCR和流式细胞术,检测胰腺癌肿瘤干细胞(Cancer Cell Stemness,CSC)标志物CD24、CD44在m RNA水平和蛋白质水平的表达。5、应用蛋白芯片检测血管生成相关基因的表达。6、应用液相芯片(Milliplex)技术检测VEGF、IL-6、IL-8、TNF-α细胞因子的水平。7、应用人脐血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)形成管腔实验,检测FH535对体外血管生成的影响。8、应用裸鼠腋下胰腺癌移植瘤模型,观察FH535对胰腺癌移植瘤生长的影响。9、应用免疫组化检测胰腺癌临床标本及移植瘤标本中的β-catenin、Ki-67、CD34蛋白的表达。根据CD34表达水平计算微血管密度(Microvessel density,MVD)。10、应用Kaplan-Meier生存分析,评价β-catenin、MVD在胰腺癌患者总生存期(Overall Survival,OS)的关系;应用Meta分析,评估β-catenin通路激活与胰腺癌预后的关系。结果:1、对FH535处理后的胰腺癌细胞差异表达的基因进行GO分析,发现FH535处理组与对照组有差异表达的基因涉及多种生物学功能,包括细胞分化、DNA损伤的修复、干细胞干性的维持等;对β-catenin Ch IP-Seq数据检测出的靶基因进行GO分析,发现β-catenin通路靶基因不仅参与细胞生物学行为的调控,还参与细胞微环境的建立,例如血管生成和细胞外基质形成。2、用FH535处理胰腺癌细胞用流式细胞术检测,发现FH535分别在m RNA和蛋白水平抑制胰腺癌细胞表面分子CD24、CD44的表达,降低CD24+/CD44+细胞群比例。提示FH535削弱胰腺癌肿瘤干细胞干性。3、用FH535处理胰腺癌细胞,发现FH535在m RNA或蛋白质水平上对多个促血管生成基因表达都有下调作用。在m RNA水平下调的促血管生成基因有:VEGF、VEGFB、FLT4、ANG、ANGPT2、AKT1、PLAU、CXCL8、IL10、IL17F、TGFA、TGFB1、FGF1、FGF13、FGFR3、PGF、HGF、IGF1、PDGFA、THPO、TNF-α、IFN-γ、TIMP1、MMP2;在蛋白水平下调的促血管生成基因有:Bfgf、IFN-γ、TIMP1、TIMP2、THPO、VEGFA、VEGFD、ANGPT1、ANGPT2、IL-1β、MCP-4、Upar、VEGFR2、VEGFR3。其中ANGPT2、FLT4、IFN-γ、PLAUR、THPO、TIMP1和VEGF基因在m RNA和蛋白水平均明显下调。在FH535处理过的胰腺癌细胞上清中,发现FH535可下调胰腺癌细胞分泌的促血管生成细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、VEGF。4、FH535抑制HUVEC形成管腔的能力,提示FH535在体外水平抑制血管生成。5、FH535处理的荷瘤裸鼠,肿瘤体积和重量都较对照组降低,证实FH535对移植瘤的生长有抑制作用。6、胰腺癌移植瘤免疫组化结果,证实FH535处理组MVD明显低于对照组,提示FH535在体内水平抑制血管生成。7、胰腺癌临床样本分析,显示细胞核β-catenin阳性表达组的MVD、Ki-67水平明显高于细胞核β-catenin阴性表达组;MVD高表达组患者的OS明显低于MVD低表达组;细胞核β-catenin阳性表达组患者的OS明显低于细胞核β-catenin阴性表达组。8、Meta分析表明β-catenin通路激活显著增加胰腺癌死亡风险,细胞核β-catenin水平越高预后越差,证实该通路激活预示胰腺癌预后不良。结论:Wnt/β-catenin通路激活在维持胰腺癌干细胞干细和促进胰腺癌血管生成中起关键作用。β-catenin通路抑制剂FH535,通过削弱胰腺癌肿瘤干细胞干性,抑制促血管生成基因的表达及下调胰腺癌细胞分泌的促血管生成因子,从而抑制胰腺癌移植瘤生长和血管生成。提示FH535可能应用于胰腺癌治疗。