【摘 要】
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目的:探讨CD137-CD137L信号通路通过调节Rab7介导的自噬促进血管平滑肌细胞（VSMC）和Apo E-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块钙化形成机制。方法:利用慢病毒载体过表达或者敲减Rab7,同时以载脂蛋白E缺陷（Apo E-/-）小鼠和C57/6J小鼠的原代VSMC为模型,应用炎症因子及重组CD137L激活CD137-CD137L信号通路,研究CD137-CD137L信号通路通过调节Rab7
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目的:探讨CD137-CD137L信号通路通过调节Rab7介导的自噬促进血管平滑肌细胞（VSMC）和Apo E-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块钙化形成机制。方法:利用慢病毒载体过表达或者敲减Rab7,同时以载脂蛋白E缺陷（Apo E-/-）小鼠和C57/6J小鼠的原代VSMC为模型,应用炎症因子及重组CD137L激活CD137-CD137L信号通路,研究CD137-CD137L信号通路通过调节Rab7介导的自噬过程对钙化的影响。实验分为两部分（1）激活CD137-CD137L信号后,利用Rab7小干扰RNA慢病毒载体和Rab7慢病毒过表达载体转染VSMC和Apo E-/-小鼠。（2）利用FYCO1小干扰RNA慢病毒载体转染原代VSMC敲减FYCO1表达。分别用HE染色、Von-Kossa染色和钙离子检测试剂盒检测AS斑块钙化和VSMC钙化。激光共聚焦监测自噬通量;透射电镜下观察胸主动脉原代血管平滑肌细胞和胸主动脉的动脉粥样硬化斑块内的自噬小体、自噬溶酶体和钙沉积。用Western blot、实时定量PCR和免疫组化方法检测钙化及自噬相关蛋白。用Rab7-GTP活性试剂盒检测CD137-CD137L信号通路激活后对Rab7活性的影响,用CO-IP和激光共聚焦检测Rab7与下游分子在自噬过程中的结合和相互作用。结果:（1）与对照组相比,炎症因子及CD137L重组蛋白（rh CD137L）激活CD137-CD137L信号,阻断了原发性血管平滑肌细胞和胸主动脉斑块的自噬通量和自噬小体的降解。（2）与对照组比较,激活CD137-CD137L信号抑制原代VSMC中Rab7的表达和活性,并且有明显的时间和剂量依赖性,浓度以10μg/m L最佳,时间以10h最为显著。（3）应用Si-Rab7慢病毒载体转染原代VSMC及Apo E-/-小鼠,Rab7基因表达明显降低,与对照组相比,敲减Rab7表达阻断了VSMC及Apo E-/-小鼠自噬通量,促进VSMC和Apo E-/-小鼠胸主动脉的钙化。（4）激活CD137-CD137L信号通路,应用Rab7过表达慢病毒载体转染原代VSMC及Apo E-/-小鼠,Rab7表达明显升高;与对照组相比,Rab7过表达改善了VSMC及Apo E-/-小鼠由CD137信号引起的自噬损伤,钙化减轻。（5）与对照组相比,激活VSMC的CD137-CD137L信号通路,CO-IP分析结果显示,阻断了Rab7和FYCO1的相互作用,激光共聚焦结果显示Rab7和FYCO1不能共定位。（6）应用Si-FYCO1慢病毒载体转染原代VSMC明显抑制FYCO1基因表达;与对照组比较,FYCO1基因减少抑制了原代VSMC的自噬通量,促进VSMC钙化。结论:（1）激活CD137-CD137L信号通路相互作用可抑制原代VSMC和Apo E-/-小鼠的Rab7活性及表达。（2）CD137-CD137L信号通路通过抑制Rab7介导的自噬促进VSMC和Apo E-/-小鼠主动脉钙化。（3）Rab7活性降低及表达减少抑制原代VSMC和Apo E-/-小鼠自噬通量,促进钙化。（4）Rab7通过调节原代VSMC和Apo E-/-小鼠自噬改善钙化是通过与下游分子FYCO1结合相互作用完成的。
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