中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是世界著名的球根花卉,也是我国传统名花中出口创汇的重要种类。由于中国水仙是同源三倍体,利用传统的杂交和实生选种方法产生新品种存在极大困难,加之野生资源高度匮乏,致使中国水仙品种单一成为我国水仙产业发展的瓶颈问题。克隆与中国水仙花型和花色发育相关的功能基因,建立优化的中国水仙遗传转化体系,不仅可以在一定程度上揭示中国水仙花型和花色的变异机理,还可为利用植物基因工程改良中国水仙的观赏性状提供理论依据和技术支持。本研究对中国水仙的两个MADS-box基因(NTMADS1和NtMADS3)、两个花色发育基因(NTPDS1和NTZDS1)和遗传转化体系进行了研究,主要结论如下:1、利用RT-PCR技术,从中国水仙‘玉玲珑’幼嫩花序中克隆到NTMADS1基因,序列分析表明,NTMADS1 cDNA片段总长为879 bp,含有完整的开放阅读框架,编码230个氨基酸。与拟南芥MADS-box基因家族的系统进化树分析表明,该基因属于AG亚族的C类功能基因。利用RT-PCR方法,研究了NTMADS1基因在开花期的组织特异表达模式,发现NTMADS1基因只在中国水仙花中表达,且丰度极高;在花的雄蕊中表达量最高,其次为副冠、雌蕊,在花瓣中几乎未检测到该基因表达。以pBI121为载体,构建了该基因的正义表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法和蘸花法,将构建好的基因分别在烟草和拟南芥中异位表达。通过对转基因植株的表型观察发现,转NTMADS1基因的拟南芥植株开花期明显早于野生型,且花型出现显著变化,如雄蕊心皮状、花瓣全部或部分退化、顶部茎生叶出现花状结构等。转基因烟草则出现花冠裂片变短且边缘不规则、花筒开裂、花药退化等现象。初步表明NTMADS1参与了花型和花期的调控。2、利用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙‘金盏银台’幼嫩花序中克隆到NtMADS3基因,序列分析表明, NtMADS3 cDNA总长为980 bp,含有一个726 bp的完整ORF,编码241个氨基酸。与拟南芥MADS-box基因家族的系统进化树分析表明,该基因与拟南芥(A. thaliana)的AGL6亲缘关系最近,属于E类功能基因。利用RT-PCR方法分析了该基因在开花期的组织特异表达模式,发现NtMADS3基因在中国水仙开花期的花、叶片、鳞片和根系中以及花的各个部位均有表达。将构建在pBI121载体上的NtMADS3基因在烟草和拟南芥中异位表达,通过对转基因植株表型观察发现,转NtMADS3基因拟南芥植株开花期明显早于野生型,但花型未出现显著变化;部分转基因植株出现植株矮小和莲座叶卷曲现象,但绝大部分表现正常。转基因烟草则出现花筒开裂、雄蕊退化或瓣化等现象。初步表明NtMADS3基因参与了花期和花型的调控。3、从中国水仙‘金盏银台’幼龄花序中克隆到中国水仙八氢番茄红素脱氢酶(NTPDS1)基因和ζ-胡萝卜素脱氢酶(NTZDS1)基因。序列分析表明,NTPDS1 cDNA片段总长为1 719 bp,含有完整的开放阅读框架,可编码含570个氨基酸;NTZDS1基因总长为1 899 bp,ORF可编码574个氨基酸。两个基因均在中国水仙的花中大量表达,且在花瓣和副冠中的表达量高于雄蕊和雌蕊;叶片和根中的表达量次之;在鳞片中表达量极少或检测不到表达。构建了两个基因的pBI121和pCAMBIA1300植物表达载体,并通过农杆菌将上述基因转入烟草和拟南芥中,得到了卡那抗性的再生植株。4、以中国水仙不同部位外植体进行了不定芽直接分化和愈伤组织诱导分化试验,结果表明,双鳞片外植体在MS0+6-BA 10.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖40 g/L+琼脂7.5 g/L培养基上可以大量地直接再生,再生芽数量平均可达13~16个/cm双鳞片,比传统的鳞茎盘之间分化提高30~50%;鳞片、叶片、花葶及花部不同组织在适宜的配方中均可不同程度地诱导出愈伤组织,但以带花药的花丝诱导出的愈伤组织最好。筛选抗生素和抑菌抗生素浓度试验表明,花丝产生的愈伤组织的选择压为潮霉素15~20 mg/L;羧苄青霉素的抑菌浓度为250~300 mg/L。