1研究目的及背景肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)属于革兰氏阴性杆菌,广泛分布于自然界,是院内和社区获得性感染的重要肠杆菌科细菌。肺炎克雷伯杆菌属条件致病菌,存在于人体的呼吸道及肠道,当人体的免疫力低下时,则会侵入人体导致人体持续的感染。它会引起一系列的感染,包括重症肺炎、泌尿道感染、胆道感染、菌血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。临床报道,化脓性肝脓肿合并脑膜炎的重症患者,其死亡率达20-55%[1]。无论肺炎克雷伯杆菌感染的部位,它都会在人体的胃肠道定植,当繁殖一定程度会形成生物膜,通过氧化应激能力和增强其耐药性来产生持续的感染,抵御人体的免疫能力[2]。近年来,随着碳青霉烯类抗生素的长期、大量、广泛使用,导致耐碳青霉烯类肠杆菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)菌株的检出率呈逐年上升趋势。2014年CHINET中国细菌耐药性监测发现,绝大多数肠杆菌科细菌中,均存在CRE菌株,以克雷伯菌属为最多,该菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率均超过10%[3]。由于CRE菌株往往呈泛耐药(extensively drug resistant,XDR)或全耐药(pandrugresistant, PDR)的特征,导致感染患者可能陷入无药可用的困境[4]。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种国际公认、简单有效的的模式生物。近年来,以其结构简单、遗传背景清晰、生命周期短等特点,在病原菌研究中的应用越来越广泛,包括研究病原菌的致病机制,宿主免疫反应以及药物筛选等方面。目前已证实大约40种人类致病菌(包括G+菌、G-菌和真菌)会对线虫造成感染,其致病机制与其在哺乳动物中的表现有极大的相似之处[5]。鉴于国内关于肺炎克雷伯杆菌感染秀丽隐杆线虫尚未报道,本文旨在建立秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯杆菌感染模型及致病性研究,为临床抗感染治疗提供实验依据。2实验方法2.1线虫的培养线虫按照国际标准程序进行培养。2.2线虫同期化处理将线虫培养基的平板放置于体视显微镜下观察,选择没有细菌污染的、产卵期成虫较多的平板,用巴氏吸管吸取M9缓冲液,反复清洗平板,确保尽可能将平板上的产卵期线虫都转入到15 ml的离心管中。用M9缓冲液从NGM培养板上洗下虫体,收集、离心、弃上清,剩余3.5 ml,加入1.5 ml的线虫裂解液,剧烈震荡约8 min,离心,用移液枪轻轻地吸取上清,注意不要触碰离心管底部的虫卵,然后继续M9洗涤3次,20℃的培养箱中培养24 h,收集L1期的线虫,获得的L1期幼虫,将其置于新的NGM平板的E.coli OP50菌苔上,20℃培养48 h,即得到同步化的L4期线虫,备用。2.3菌悬液的配置从-80℃冰箱中取出塑料冻存管,然后将冻存的细菌放入5 ml的LB培养液中,放置于培养箱中,调整温度为35℃,培养12-18 h。应用平板划线法进行接种、培养,37℃、18-20 h,分离出单个菌落。挑取单个的菌落,再接种于5 ml的LB液体培养基中,放入恒温恒湿的培养箱,35℃、150 r/min震荡培养一定时间,采用比浊仪调整细菌的浓度为0.5麦氏单位,然后做进一步稀释至所需要的浓度。2.4线虫感染液体致死实验将培养至L4期的线虫用M9缓冲液从平板上冲洗下来,离心(3500r/min,3 min),重复2-3次,悬浮后取10 u1的M9缓冲液,在显微镜下观察线虫悬液中线虫的数量,然后分别取含有20-30条线虫的悬液置于96孔板中,感染组加入终浓度为1.5×108 CFU/ml、1.5×107 CFU/ml、1.5×106 CFU/ml的XDRKP;终浓度109CFU/ml E.coli OP50作为阴性对照组,20% LB溶液作为空白对照组；每种菌液做5个平行,其中为了防止N2线虫繁殖,滴加0.2mmol/L的FUDR,96孔板放置于相对湿度80%-85%的培养箱,20℃培养,每天记录线虫的存活数。所有组均重复3次。2.5线虫肠道内细菌计数及鉴定2.5.1 线虫肠道内细菌计数为确定线虫肠道内肺炎克雷伯杆菌的定植及繁殖,参照文献报道[6]的细菌计数方法。选取1.5×108 CFU/ml XDRKP感染线虫,每孔含有20-30条线虫的悬液置于96孔板中,每隔一定的时间,从1个空中挑取10条经细菌感染的线虫,用含有1 mmol/L NaN3(麻醉剂)的M9缓冲液清洗3遍,以清除线虫体表的细菌,然后转移至装有400 mg石英砂的小试管,加1 ml PBS缓冲液,涡旋振荡2-3 min,得到的上清悬浮液稀释涂布,计数,以确定每条线虫体内细菌数量。各时间点均计数6次。2.5.2线虫肠道内细菌鉴定经上述2.5.1步骤得到的上清悬液,于LB固体平板划线法分离单菌落,经细菌纯培养后,由美国BD公司生产的PHOE-NIX-100型全自动细菌鉴定仪重新鉴定及药敏测试。2.6不同耐药程度KP对线虫致病性研究选取终浓度1.5×108CFU/ml不同耐药程度的KP感染线虫,每孔含有20-30条线虫转移至96孔板,感染组：分为A、B、C三组,分别加入菌株A(敏感菌株)、菌株B(多重耐药菌株)、菌株C(泛耐药菌株)；阴性对照组：E.Coli OP50。每种菌液做5个平行,其中为了防止N2线虫繁殖,滴加0.2 mmol/L的FUDR,在20℃培养指定的时间,每天记录线虫的存活数。所有组均重复3次。2.7感染线虫的救治实验选取1.5×108 CFU/ml的MDRKP和XDRKP感染线虫(方法同2.4),经过24 h细菌感染的线虫用M9缓冲液清洗后,转入含20%LB的M9缓冲液,用96孔板进行培养。抗感染治疗组：加入不同浓度抗生素(0、2、8、32 ug/ml美罗培南及0、0.08、0.4、2和10 ug/ml替加环素)；阴性对照组：不加任何抗生素,对线虫进行抗感染治疗。每组实验平行做3组。2.8救治实验线虫肠道内细菌计数在表观观察线虫存活数量和状态的基础上,对替加环素10 ug/ml救治的线虫进行了体内细菌跟踪计数(方法同2.6)。2.9统计分析应用SPSS 20.0软件,采用Kaplan-Meier方法进行生存分析,Log-rank检验法对组间的数据进行差异显著性分析。计量资料采用完全随机设计方差分析,两两比较采用SNK检验分析。P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。3结果3.1 XDRKP对线虫的感染致死的判定XDRKP线虫的感染情况,在液体实验条件,观察到活虫呈正弦曲线特征,咽部肌肉运动；而XDRKP感染的死亡线虫呈直线型,咽部无运动。3.2不同浓度XRDKP对线虫感染的致死作用本实验根据病原菌自身生长特点,对数生长末期收集的菌液,线虫感染后活动明显迟缓,效果明显。实验采用不同细菌浓度XDRKP感染线虫,以线虫是否死亡为结局变量,记录线虫的生存状况以及做生存分析。结果显示,其中7 d观察线虫生存状况,不同细菌浓度(1.5×108CFU/ml、1.5×107CFU/ml、1.5×106 CFU/ml XDRKP 以及109 CFU/ml E.coli OP50对照组)的线虫平均存活率分别为0%、25.31%、83.95%、100%。随着细菌浓度减少,线虫的最长存活时间与线虫半数致死时间(lethal time of 50%,LT50)有所延长,如表1所示。采用log-rank检验显示,1.5×106CFU/ml XDRKP组与109CFU/ml E.cili OP50对照组的生存曲线无统计学差异(χ2=0.08,P>0.05),1.5×108CFU/ml组与109CFU/ml E.coli OP50对照组的生存曲线有统计学差异(χ2=275.98,P<0.001),1.5×107CFU/ml XDRKP组与109CFU/ml E.coli OP50对照组的生存曲线有统计学差异(χ2=229.37,P<0.001),说明1.5×108CFU/ml与1.5×107CFU/mlXDRKP组的生存率低于对照组。3.3感染实验线虫肠道内细菌鉴定及计数在表观观察线虫存活数量和状态的基础上,感染不同时间对线虫进行了体内细菌跟踪计数。经方差分析,不同时间XDRKP感染线虫体内细菌总量存在统计学差异(F=1363.389,P<0.001)。经SNK检验显示,各时间点间体内细菌总量均有统计学差异(P<0.05),说明在实验时间范围内,随时间延长,XDRKP感染线虫体内细菌总量逐渐增加。实验得到的上清悬液,经细菌纯培养后,进行细菌鉴定和药敏测试,结果鉴定证实为XDRKP。3.4不同耐药程度的肺炎克雷伯杆菌对线虫的致死作用实验采用不同耐药程度的肺炎克雷伯杆菌感染线虫,以线虫是否死亡为结局变量,记录线虫的生存状况以及做生存分析。结果显示,随着耐药程度的增强,线虫的最长存活时间与LTso都有所降低,如表3-4所示。采用log-rank检验显示,A组与B组(χ2=56.08,P<0.001)、A组与C组(χ2=107.69,P<0.001)、B组与C组(χ2=14.60,P<0.001),三组之间的生存曲线均有统计学差异,说明随着耐药性增强,同时也增强了对线虫的致死性。3.5抗生素对感染线虫的救治3.5.1美罗培南与替加环素对MRDKP感染线虫的救治实验采用美罗培南(0、2、8、32 ug/ml)和替加环素(0、0.08、0.4、2和10 ug/ml)分别对MDRKP感染的线虫进行救治。以线虫是否死亡为结局变量,记录线虫的生存状况以及做生存分析。随着美罗培南治疗浓度的增加,MDRKP感染线虫的最长存活时间与LTso都有所延长。采用log-rank检验显示,2 ug/ml美罗培南救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ2=3.028,P=0.08)；8 ug/ml美罗培南救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=21.821,P<0.001)；32 ug/ml美罗培南救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=146.096,P<0.001),说明8ug/ml、32 ug/ml美罗培南救治组的生存率高于对照组。随着替加环素治疗浓度的增加,MDRKP感染线虫的最长存活时间与LTso都有所延长。采用log-rank检验显示,0.08ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ2=0.116,P=0.73)；0.4 ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=35,462,P<0.001);2 ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=106.159,P<0.001),10 ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=264.426,P<0.001),说明0.4 ug/ml、 2ug/ml、10 ug/ml替加环素救治组的生存率高于对照组。3.5.2美罗培南与替加环素对XRDKP感染线虫的救治实验采用美罗培南(0、2、8、32 ug/ml)和替加环素(0、0.08、0.4、2和10 ug/ml)分别对XDRKP感染的线虫进行救治。以线虫是否死亡为结局变量,记录线虫的生存状况以及做生存分析。随着美罗培南治疗浓度的增加,XDRKP感染线虫的最长存活时间与LTso未有延长。采用log-rank检验显示,2 ug/ml美罗培南救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ2=0.749,P=0.39)；8 ug/ml美罗培南救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ2=1.841,P=0.17)；32 ug/ml美罗培南救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ2=0.150,P=0.69),说明2ug/ml、8ug/ml、32 ug/ml美罗培南对感染线虫均没有治疗效果。随着替加环素治疗浓度的增加,XDRKP感染线虫的最长存活时间与LTso都有所延长。采用log-rank检验显示,0.08ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ2=0.316,P=0.57)；0.4 ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=28.124,P<0.001)：2 ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=94.767,P<0.001),10 ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ2=267.963,P<0.001),说明0.4 ug/ml、2 ug/ml、10 ug/ml替加环素救治组的生存率高于对照组。3.6救治实验线虫肠道内细菌计数在表观观察线虫存活数量和状态的基础上,选择替加环素10 ug/ml救治的线虫进行了体内细菌跟踪计数。经方差分析,不同时间点线虫体内细菌总量整体比较存在统计学差异(F=1267.23,P<0.001)。经SNK检验显示,各组之间体内细菌总量均有统计学差异(P<0.05),说明在实验时间范围内,随时间延长,线虫体内细菌数量逐渐下降,替加环素救治效果显著。4结论4.1 本文利用临床分离的XDRKP菌株,成功建立了秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯杆菌感染模型,并证实XDRKP在线虫体内定植且不断繁殖导致线虫的死亡。4.2不同耐药程度的KP感染线虫,随着耐药程度的增强,KP对线虫的致病性也逐渐增强。4.3美罗培南及替加环素对感染线虫的救治,随着抗生素浓度的增加,对线虫起到一定的治疗作用,体内实验结果与体外药敏具有一致性。