研究背景：白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,白血病细胞以异常增生、分化受阻、凋亡受抑为主要特征,而正常造血受抑制。近年来,新型化疗药物及改良化疗方案的推出使治疗取得了巨大进步,异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)极大提高了白血病患者的生存率[1]。然而原发及继发耐药依然是临床上亟待解决的问题,初诊原发耐药患者化疗效果欠佳且易复发,治疗过程中的继发耐药亦常常成为复发的根源[2]。因此对白血病耐药相关机制及可能涉及的关键分子及通路异常进行详细而深入的探索,对早期诊断及克服耐药具有十分重要的现实意义。Eph受体(Ephrin type receptor precursors)是膜受体酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases)中最大的一个亚群,分为A、B两个亚型,与其配体ephrinA及EphrinB家族分子亦表达于胞膜。位于不同细胞表面的受体Eph与配体Ephrin分子通过细胞间粘附作用相结合后,两者可同时发生酪氨酸磷酸化,使得其酪氨酸激酶活性被激活,从而介导双向信号传递[3]。多项研究发现在生理状态下,Eph受体分子与神经细胞发育、血管生成及组织边界形成密切相关[4-5]。而新近研究发现多种肿瘤细胞高表达Eph,促进肿瘤的发生发展及耐药,但其具体机制尚不清楚,为此2008年6月28日在美国温斯顿举行了第一届"Eph/Ephrin和肿瘤”专题会议。Eph/Ephrin已成为目前国内外学者关注的热点之一[6]。目前B亚型的EphB4的研究最详尽,EphB4与其配体ephrinB2特异性结合后胞内段酪氨酸发生磷酸化而被对方激活,EphB4活化后具有酪氨酸激酶功能,进而激活Ras、Rac、Rho、Rapl及FAK等蛋白,从而向细胞传递血管生成、组织边界形成、细胞迁移、轴突导向和塑型以及骨稳态调节等信号,并在肿瘤等病理条件下也发挥相应作用[7-8］。近年来,已有越来越多的研究发现EphB4在多种肿瘤中存在EphB4异常高表达或活化,如乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、间皮瘤、宫颈癌等[9-15］,EphB4可通过激活一系列细胞信号通路影响肿瘤细胞的生物学行为,对肿瘤的发生发展及耐药起重要作用,与预后密切相关。敲除EphB4基因或干扰EphB4/ephrinB2的相互识别结合后,可增强肿瘤细胞对药物的敏感性,并可导致肿瘤细胞凋亡,因此EphB4被认为是保护肿瘤的“哨兵”,但EphB4具体通过哪些机制改变肿瘤细胞生物学特性至今不明确。且纵观目前针对EphB4分子在肿瘤中的研究结果,仍存在众多争议,即EphB4在部分肿瘤中可促进肿瘤发生发展,但在另一些肿瘤中亦可扮演抑癌基因的角色[16]。而目前,EphB4在肿瘤中的研究主要集中于实体瘤,在血液肿瘤中的研究鲜见报道,我们的前期研究发现EphB4在难治、复发性髓系白血病患者较正常及初发患者表达增高,而白血病复发耐药往往与肿瘤细胞增强的癌性生物学行为密切相关。综上所述,对EphB4表达及其活性在髓系白血病耐药中的作用进行探讨,可能为克服及逆转耐药提供新的分子靶点。研究目的：选取5种代表不同分化阶段的粒、单核系髓系白血病细胞株为研究对象,分别是：KGlα、HL60、HL60/ADM (HL60耐阿霉素细胞株)、K562、U937。通过检测各细胞株对临床上常规蒽环类化疗药物-阿霉素的耐药性,同时检测各自EphB4的表达、酪氨酸磷酸化水平及配体EphrinB2的表达,探讨EphB4与细胞耐药的相关性。进一步通过上调EphB4酪氨酸磷酸化水平后,检测HL60/ADM细胞增殖及凋亡的变化,明确EphB4酪氨酸磷酸化活性对髓系白血病细胞耐药性的影响,最后以生物信息学技术挖掘与EphB4介导髓系白血病细胞耐药的相关细胞信号转导通路,预测其参与耐药的可能机制。研究方法：1、CCK-8法检测K562、HL60/ADM、HL60、U937、KG1α对梯度浓度阿霉素的耐药性,通过计算细胞抑制率,得出各自IC50值,并行统计学分析；2、提取K562、HL60/ADM、HL60、U937、KG1α五种细胞的总RNA及总蛋白,分别行RT-PCR及western blot分析,检测EphB4在上述五种细胞中的蛋白及mRNA水平的表达。3、提取K562、HL60/ADM、HL60、U937、KG1α五种细胞的磷酸化蛋白,以磷酸化ELISA方法检测EphB4在上述五种细胞中的酪氨酸磷酸化水平；4、分别以不同浓度的可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白刺激EphB4表达最高的HL60/ADM细胞,观察细胞EphB4酪氨酸磷酸化水平的改变。5、以可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白刺激HL60/ADM细胞,上调其EphB4的酪氨酸激酶活性,同时设以0.4ug人IgG Fc蛋白处理组与空白对照组,观察三个处理组对梯度阿霉素耐受性的差异。6、以可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白分别刺激HL60/ADM细胞0h、30min,1h、8h、24h,观察细胞EphB4表达及其酪氨酸磷酸化水平的变化。7、采用pSTRING在线软件及PANTHER数据库挖掘与EphB4相互作用的蛋白,分析这些蛋白可能涉及的与细胞耐药相关的信号通路。研究结果：1、CCK-8法检测K562、HL60/ADM、HL60、U937、KG1α细胞株对梯度阿霉素耐药性,HL60/ADM耐药性最高,其次为K562及KG1α, U937与HL60耐药性最低。2、RT-PCR及western blot检测5株细胞EphB4表达结果均发现K562、HL60/ADM、KG1a均存在不同程度的高表达,而在HL60、U937细胞中表达水平极低,提示EphB4蛋白表达可能参与细胞对常规蒽环类药物的耐药。3、磷酸化ELISA检测5株细胞EphB4酪氨酸磷酸化水平,发现5株细胞均呈低磷酸化水平,各类细胞株之间EphB4磷酸化水平无统计学差异。4、根据预实验及参考相关文献,以可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml剂量刺激EphB4表达量最高的HL60/ADM细胞株,可见其酪氨酸磷酸化水平增高,且呈剂量依赖效应。5、以可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白4ug/ml的浓度刺激HL60/ADM细胞30min以上调其EphB4酪氨酸激酶活性,发现细胞增殖抑制率及凋亡率均较Fc处理组增高,而Fc处理组与空白对照组则无明显差异,EphB4酪氨酸磷酸化水平增高可降低细胞对阿霉素的耐药性。6、以可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白分别刺激HL60/ADM细胞Oh、30min,1h、8h、24h后,其酪氨酸磷酸化水平在刺激1h后开始出现明显下调,24小时降至最低；western blot检测发现EphB4表达从刺激后1h亦开始降低,24小时降至最低。7、采用pSTRING在线软件及PANTHER数据库分析发现,EGFR和VEGF信号通路可能是EphB4介导髓系白血病耐药的关键通路,且EphB4与此两条通路的联系不依赖于其酪氨酸激酶结构域。结论：1、EphB4在对阿霉素耐药性较高的髓系白血病细胞中在mRNA及蛋白水平均呈现不同程度的高表达；2、但其酪氨酸磷酸化活性在各个细胞株中普遍呈低水平状态,以具有活性的可溶性重组人Ephrin-B2/Fc配体融合蛋白刺激高表达EphB4的HL60/ADM细胞株,可使其发生酪氨酸磷酸化,且磷酸化水平增高呈剂量依赖效应；3、在高表达EphB4的HL60/ADM细胞株中上调EphB4磷酸化活性后,细胞对阿霉素耐药性降低,表现为增殖受抑,凋亡增加；提示EphB4磷酸化可能对细胞耐药起负调控作用；4、EphrinB2/Fc处理HL60/ADM细胞30min后,细胞EphB4蛋白表达水平无明显增高,但1小时后开始出现下调,24小时后降至最低,而IgG Fc处理组及空白对照组各时间点细胞的EphB4表达水平无明显变化。提示EphrinB2/Fc处理后可能导致了受体EphB4分子表达的下调。高表达的EphB4蛋白可能通过酪氨酸激酶以外的其他功能域来促进白血病细胞对葸环类药物发生化疗抵抗,其酪氨酸激酶活性可能不参与白血病的耐药。5、进一步通过生物信息学技术分析,发现EphB4可分别通过其Ⅲ型纤维粘连蛋白结构域及PDZ结合区而非酪氨酸激酶结构域与EGFR和VEGF信号通路的关键分子相互作用,EGFR和VEGF信号通路的异常激活可能是EphB4介导髓系白血病耐药的关键途径。