研究背景川崎病（Kawasaki Disease,KD）是一种原因未明的全身性中、小血管炎反应综合征,其主要临床特点包括发热、皮肤粘膜损害、颈部淋巴结肿大等,本病是日本的儿科医生川崎富作在1967年首次报道,其主要损害是冠状动脉病变,早期表现为冠状动脉扩张、冠状动脉动脉瘤,恢复期可形成冠状动脉狭窄、血栓形成以及心肌梗死等,严重可导致死亡。未经治疗的患儿约20%～25%可导致冠状动脉病变。此病多发于5岁以下儿童,发病人群主要为亚裔人群。2012年日本流行病学报告小于5岁的儿童KD发病率为264.8/10万,国内流行病学资料表明,北京市2000年至2004年5岁以下儿童发病率为（40.9～55.1）/10万,上海市2013至2017年5岁以下儿童发病率68.8～107.3/10万,呈逐年升高趋势,而且近些年来发病率越来越高,当前KD已是儿童最常见后天性心脏病主要病因之一。KD的发病病因及机制尚不明确。当前的研究认为KD在遗传易感性基础上,由外源性抗原触发,引起机体免疫机制紊乱所致全身中小血管炎。流行病学研究显示KD的发病率存在明显的种族之间差异,以亚裔的人群发病率较高以及同胞之间发病率高,提示KD的发病机制有一定的遗传易感性因素参与。整合素α2（Integrinα2,ITGA2）是重要的胶原蛋白受体,在上皮细胞和血小板中表达较高,在血小板以及纤维胶原的粘附过程中具有非常重要的作用,粘附过程会导致血小板的激活和血栓的形成,在冠心病、动脉粥样硬化、脑卒中、肿瘤及免疫性炎症反应等中发病中发挥着重要作用。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等不同类型且其中发生率大于1%的变异。然而ITGA2基因SNP与KD冠状动脉病变相关的关系,查阅国内外文献,我国汉族人群中尚无该基因多态性与KD相关报道,本研究探讨ITGA2在我国汉族人群中的KD分布情况以及研究ITGA2的基因单核苷酸多态性与KD冠状动脉病变相关性,为进一步改善KD患儿预后提供理论依据。微小RNA（microRNAs,miRNA）是一组约20个左右核苷酸高度保守的非编码RNA,广泛存在于自然界中。研究发现miRNA在心血管疾病、免疫性疾病及肿瘤等多种疾病的发生发展中,通过与靶基因的3’端（非翻译区）区域部分序列相结合,互补后降解已转录的靶基因mRNA,或者抑制靶基因编码蛋白进而对疾病发生发展起到作用。血浆miRNA作为生物标志物以及用于诊治疾病是目前研究的热点。因miRNA在组织和血液的表达相对稳定,不容易被核酸酶消化,且miRNA的表达在不同种类疾病、组织和细胞中具有特异性。所以导致血浆miRNA在各种疾病早期诊断以及药物开发等临床基础方面的研究全面开展。对于血浆miRNA在KD作用机制尚未完全清楚,因此,本研究以筛选出KD的明显差异表达血浆miRNA的差异表达为切入点,通过茎-环的RT-PCR方法检测和验证明显差异表达miRNA,分析其生物学功能,为进一步研究发病机制和发现新的生物学标志物是KD早期诊断、治疗重要内容,最终为KD合并冠状动脉损伤的患儿早期诊断和基因靶向的治疗并改善预后提供理论依据。KD的诊断主要是依靠临床的表现,尚未特异性诊断指标,能否早期诊断及治疗KD是影响KD冠状动脉病变预后的关键。KD治疗方案主要为静脉输注丙种球蛋白（Intravenous Immune Globulin,IVIG）及口服阿司匹林治疗,经规范治疗后KD冠状动脉病变发生率可下降至5%左右。阿司匹林具有抗炎作用,可缩短发热时间和抗血小板作用,因此是最初治疗KD的疗法之一。meta分析表明,阿司匹林治疗不影响冠状动脉瘤形成。自从KD患儿应用IVIG治疗在1983年首次报道,之后的研究证实IVIG能够降低KD合并冠状动脉病变发生风险,在KD病程第7～10天内治疗可得到最好效果。但第10天后仍存在持续发热、炎症指标升高和/或冠状动脉病变的患儿也应给予大剂量IVIG治疗。也有日本研究显示病程4天内时早期开始治疗者更容易出现IVIG无反应。2017年AHA发布的《川崎病诊断、治疗与长期管理的新科学声明》建议诊断者明确尽早使用IVIG,诊断时间最早可提前到发病第3天。虽然IVIG作用的机制仍不明确,但IVIG具有全身性抗炎作用,能够减轻发热并减少急性反应物,其可能机制包括:调节细胞因子的水平和生成、增加T细胞抑制因子活性、下调抗体合成、对补体系统的作用、以及提供抗独特型抗体。虽然使用大剂量IVIG可预防KD冠状动脉病变,但IVIG的时机和有效性对中期KD冠状动脉结局影响仍需进一步确定。目的1.探讨我国汉族儿童整合素α2的基因单核苷酸多态性与KD冠状动脉病变相关关系。2.探讨miRNAs与KD冠状动脉病变发病机制相关关系。3.分析大剂量IVIG治疗时机对KD冠状动脉病变结局的影响及影响KD冠状动脉病变的高危因素。方法1.应用病例-对照研究的方法,我们选择对ITGA2基因位点,利用NCBI dbSNP数据库和SNP info信息,筛选符合以下标准的研究SNPs:（1）在HapMap数据中报道的中国汉族后代中等位基因频率≥5%并且不包含于已有的KD全基因组范围关联研究中;（2）位于基因调控区或影响转录因子结合位点活性或启动子中的微小RNA结合位点活性或改变外显子中的氨基酸。采用卡方检验比较一般资料以及SNP基因型在KD研究组及对照组中的分布差异。采用单因素及多因素logistic回归分析来计算比值比（OR）、校正OR及95%置信区间（CI）用来评估关联的程度。2.通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测KD患儿在IVIG治疗前、后及正常健康儿童血浆中的miRNA差异表达的建立。筛选出选择明显差异表达的miRNA在更大的样本临床资料中进一步验证。关键miRNA在KD冠状动脉病变的作用机制研究。3.本研究回顾性分析在2015年1月至2017年12月期间诊断为KD患儿,随访终点2018年12月。该项研究已在中国临床试验注册中心登记。本研究主要指标是入院时超声诊断冠状动脉病变及12月内随访心脏超声结果。次要指标是IVIG治疗前后炎症指标。以ROC曲线下面积、敏感性和特异性为指标筛选出评价IVIG治疗KD的预防冠状动脉病变（coronary artery lesions,CALs）最佳时机,采用t检验和卡方检验比较各组别人口学特征、炎症指标以及冠状动脉病变构成比,应用单因素及多因素logistic回归分析KD冠状动脉病变因素。结果1.ITGA2基因SNP与KD冠状动脉病变的相关性。本研究随机选择KD组818例,选择同时期的年龄、性别想匹配1401例健康儿童作为对照组,符合标准所选择血小板活化通路核心基因ITGA2基因C807T（rs1126643）。该基因型在KD组及对照组中性别、年龄存在着差异无统计学意义。818例KD根据有无并发冠状动脉瘤（coronary artery aneurysms,CAAs）,分为两个亚组,其中CAAs组116例（14.18%）,702例（85.82%）患儿为无CAAs组。研究人群中ITGA2基因型的HWE=0.9626>0.05,说明本次研究对整个群体具有一定的代表性。多因素logistic回归分析ITGA2基因C807T（rs1126643）在KD组及对照组差异有统计学意义。与健康对照组相比,相对于我们发现ITGA2基因C807T（rs1126643）T等位基因低于对照组,差异有统计学意义（p<0.05）。OR值<1为保护因子。相对于rs1126643野生型CC基因型,经过年龄、性别校正后,TT基因型携带者患儿患病的风险降低了 38%（校正 OR=0.62,95%CI=0.43-0.88,p=0.0078）,TTvsCT+CC（校正 OR=0.63,95%CI=0.44-0.889,p=0.0093）。我们发现 ITGA2 基因C807T（rs1126643）TT基因型对KD具有保护作用。进一步分层分析表明,当ITGA2基因C807T（rs1126643）CC/CT作为对照基因型,TT基因型者在年龄≤60月龄,女性患儿及KD无CAAs更具显著保护作用。2.miRNA与KD冠状动脉病变的相关性研究,选择5例KD合并冠状动脉病变在IVIG治疗前、后患儿血浆的具有明显的差异miRNA,芯片结果显示miR-126在KD患儿治疗前明显降低,IVIG治疗升高（大于2倍以上）。选择进一步扩大样本到10例KD合并冠状动脉病变接受大剂量IVIG治疗治疗前、后患儿及5例健康儿童作为对照组采用实时荧光定量PCR研究方法进行检测验证差异表达miR-126。定量PCR显示差异表达miRNAs在KD治疗前患儿中明显低表达但在健康儿童、接受IVIG治疗的KD合并冠状动脉病变患儿检测到表达的候选miRNAs,统计结果显示,在所验证的差异miRNA分子中,miR-126在KD IVIG治疗中明显差异表达,具有统计学差异（p<0.05）,说明筛选结果可靠。前期研究结果显示治疗过后的KD患儿血浆miR-126表达量增高,上述资料表明miR-126是对于血管内皮有积极作用的。使用较为权威的数据库Target Scan在线软件对的miRNA-126的靶基因进行预测miR-126,双荧光素酶报告基因实验明确miR-126与靶基因SPRED1相结合（p<0.05）,差异有统计学意义。说明miR-126能通过结合SPRED1基因3’UTR影响其荧光活性改变。用Western-Blot实验方法,验证与SPRED1因子相关的细胞信号通路蛋白,miR-126 mimics 其靶基因 SPRED1 表达量下调,增强了 VEGF,FGF-1,Ras-p21,MAPK-p38蛋白水平依次增加为1.67倍,1.93倍,1.76倍和1.86倍,加入miR-126 Inhibitor后,miR-126 inhibitor组的SPRED1蛋白水平是Cell组的1.51倍,同时受到负调控因子的SPRED1的调控,VEGF,FGF-1,Ras-p21及MAPK-p38的蛋白水平依次减少为0.54,0.64,0.59和0.63,实验证实miR-126有利于促进血管内皮细胞生长。将miR-126 mimic及inhibitor的小分子转染HCAEC,结果表明,miR-126 mimic导致HCAEC细胞活力上调,细胞周期发生变化,处在G2期的细胞比例显著增高,而处在S期的细胞比例显著降低（p<0.05）。而转染miR-126 inhibitor后HCAEC的反应则相反。其细胞活力显著下降,G2期细胞比例显著降低,而S期细胞比例无变化（p<0.05）。表明KD患儿miR-126的确能够对HCAEC起积极作用,通过治疗后KD患儿血液内miR-126表达量上升,病情好转。本研究结果证实miR-126在KD合并冠状动脉病变的通过关键靶基因SPRED1的调控血管生成因子VEGF,FGF-1作用的分子机制。3.IVIG治疗时间对KD冠状动脉病变结局的影响。研究3年时间符合入选标准并随访12月1281例KD患儿。ROC曲线显示IVIG治疗时间预测KD冠状动脉病变的最佳天数为7.5天,ROC曲线下面积为0.80（95%CI=0.76-0.84,p<0.001）。本研究中816例（56.9%）为男性,465例为女性患儿（43.1%）。患儿中位年龄为12个月（11-36个月）,141例（11%）为IVIG无反应KD患者。患儿接受IVIG治疗的中位数时间为6天,诊断时339例（26.5%）有CALs,94 例（7.3%）有 CAAs。随访 12 个月,39 例（3.0%）仍存在 CALs,23 例（1.8%）持续存在CAAs。根据IVIG治疗时间将所有病人分为4组:第1组为发病第4天内接受IVIG治疗,第2组为发病第5-7天内接受IVIG治疗,第3组为发病第8-10天内接受IVIG治疗,第4组为发病后10天以后接受IVIG治疗。第1组77例、第2组817例、第3组249例和第4组138例。第4组IVIG无反应率高于其他3组,差异有显著性（p=0.001）。入院诊断KD时,心脏彩超CALs在第1至4组分别 14.1%,19.5%,35.3%和 58.7%;CAAs 在第 1 至 4 组分别 2.6%,3.5%,8.4%和30.4%。随访12个月,第3、4组CALs和CAAs发生率均高于第1、2组,差异有显著统计学意义（p<0.001）。CALs和CAAs在第1、2组构成比不同,但差异无统计学意义。第2组与第3组相比,两组之间比较存在差异并统计学意义（p<0.05）,1 月时 KD 患 CALs 及 CAAs 相对风险分别为 OR 2.1（95%CI 1.4-3.0）,OR 3.9（95%CI 1.9-8.2）,12个月时KD患CALs及CAAs相对风险分别为OR 5.3（95%CI 2.0-13.9）,OR 13.5（95%CI 2.9-14.1）。根据12月随访结果影响KD合并CALs多因素logistic回归分析,将患儿的年龄、性别、发热持续天数、IVIG使用病程天数、IVIG无反应、白细胞、中性粒细胞百分比以及C-反应蛋白8个因素做单因素分析,筛选有意义自变量进行多因素logistic回归分析,结果显示IVIG使用病程天数、丙球无反应与是KD合并CALs独立危险因素（p<0.001）。结论1.血小板活化通路核心基因位点ITGA2 C807T（rs1126643）基因多态性改变可能与中国人群的KD发病以及KD合并冠状动脉病变遗传易感性有关,此结果尚需要更大规模前瞻性研究进一步验证。2.差异表达的miR-126在KD治疗前表达明显下降,IVIG治疗后明显升高,通过直接下调控靶基因SPRED1,导致VEGF,FGF-1,Ras-p21及MAPK-p38的表达量增加,从而促进血管生成的活化。提示miR-126及其靶基因SPRED1可能与KD冠状动脉病变的发生、发展过程有关,可能成为KD合并冠状动脉病变潜在的早期诊断标志物和治疗新靶点。3.本研究表明IVIG治疗在KD病程7天内可更好有效预防冠状动脉病变。IVIG治疗在病程4天内并不会增加冠状动脉病变发生率和IVIG无反应的发生率。IVIG使用天数、IVIG无反应是KD合并CALs高危因素,因此建议大剂量IVIG对急性期KD治疗越早越好。