目的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病,多发于中老年人,65岁以上老年人群患病率为1%～2%,严重影响了患者的身体健康和生活质量。其主要病理特征为黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元的进行性、广泛性变性、缺失及α-突触核蛋白(α-synuclein)路易小体(Lewy body,LB)的出现。多巴胺(dopamine,DA)能神经元的缺失导致纹状体内多巴胺的水平下降,从而引起一系列临床症状,主要表现为静止性震颤、姿势步态异常、肌强直等运动障碍以及嗅觉减退、便秘、抑郁等非运动症状(NMS)。帕金森的发病机制十分复杂,包括遗传易感性、氧化应激、线粒体缺陷、神经免疫炎症、神经兴奋性毒性、异常蛋白的集聚等,这些因素都会引起细胞凋亡的发生,因此在疾病的发生发展过程中,多巴胺能神经元的过度凋亡是神经退行性病变的中心环节。目前临床上常用于治疗PD的药物为左旋多巴类,但长期用药后会出现开关现象、剂末现象、精神症状等副作用。所以,寻找能够预防和延缓疾病进程的药物成为迫切需要。甘松来源于败酱科植物甘松(Nardostachys jatatansi DC.)的干燥根及根茎,辛、甘、温,具有理气止痛、开郁醒脾等功效。主要含有萜类化合物,其中以倍半萜类为主。甘松具有镇静、抗惊厥、抗癫痫、抗抑郁、调节内分泌等药理作用,前期研究表明甘松乙醇提取物对于缓解帕金森病有一定的疗效,其主要成分甘松新酮具有促原代培养神经细胞增殖及显著的抗缺糖缺氧损伤的作用、且对皮质酮诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。推测甘松对帕金森病的预防治疗起到积极的作用,因此采用6-OHDA作用于SH-SY5Y细胞,建立体外PD模型,在评价甘松抗帕金森活性的基础上,对其抗帕金森活性成分及可能的作用机制进行探讨,为抗帕金森药物的开发提供一定的理论和实验依据。方法1采用6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞建立帕金森体外细胞模型,不同浓度的6-OHDA处理后,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态,确定6-OHDA最佳浓度。2制备甘松醇提取物的不同部位,进行抗6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤活性筛选,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测甘松提取物处理后细胞的存活率,倒置显微镜观察细胞形态,筛选活性部位。3采用GC-MS联用技术结合HPLC方法对甘松石油醚部位的化学成分进行分析。4通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率、LDH试剂盒检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性、Hoechst33258染色法检测细胞凋亡情况、及利用DCFH-DA荧光探针检测细胞ROS水平等药效学方法,研究甘松新酮对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。5通过罗丹明123检测细胞线粒体膜电位、Western Blot法检测细胞内线粒体凋亡途径及MAPK通路相关蛋白表达的影响,探讨甘松新酮对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤保护作用的相关机制。结果主要研究内容及结果如下:1帕金森体外细胞模型的建立不同浓度的 6-OHDA(25μM、50μM、100μM、150μM、200μM、300μM)与细胞共同孵育24h后,进行细胞活性检测,细胞存活率显著降低并呈剂量依赖性。6-OHDA处理浓度低于50μM时,细胞损伤程度不够;处理浓度为150μM时细胞存活率为50.87%,损伤程度适中;倒置显微镜下观察细胞状态,正常对照组细胞贴壁后生长良好,呈梭形、多边形或不规则的三角形;经150μM6-OHDA处理的模型组细胞皱缩破损,胞体变圆、细胞数量减少,形态学损伤明显,因此本实验选择150μM的6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型。2甘松不同部位的制备及抗帕金森活性的筛选2.1甘松醇提取物不同部位的制备参考文献方法,实验确定甘松醇提取物不同部位制备的条件为:甘松分别用10、8、8倍量80%乙醇超声提取3次,时间分别为60、45、45min,合并滤液,减压浓缩为浸膏并用10倍量蒸馏水混悬,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇至无色。合并各萃取液,减压回收溶剂得各部位浸膏。2.2甘松不同部位对6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞保护作用筛选MTT检测结果显示,与模型组细胞存活率比较,甘松各提取物作用后均可增强6-OHDA损伤细胞的存活率,对神经细胞损伤有明显的保护作用。各给药组之间进行比较,据药物对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的抑制率显示,在一定浓度范围内,石油醚部位的抑制作用最强,抑制率为49.53%,即该部位对细胞损伤的保护能力最强,因此对该部位进行深入的实验研究。3甘松石油醚部位的化学成分分析运用GC-MS方法对甘松石油醚部位进行成分鉴定及含量分析,各色谱峰相应的质谱图经NIST11谱库自动检索并核对标准质谱图,进行分子结构鉴定与比较,确认化学成分并利用峰面积归一化法分析石油醚萃取物中各化合物的相对百分含量,从该部位中分离鉴定了22个化合物。主要为饱和醇、酮、酸,其中以倍半萜类含量最高,占总量的53.46%,主要成分有喇叭烯氧化物-(Ⅱ)(23.91%)、4a-7-亚甲基架桥-4aH-萘酚[1,8a-b]环氧乙烯,八氢-4,4,8,8-四甲基-,(1aαa,4 aα,7α,8aS)-(9CI)(22.87%)、表蓝桉醇(3.43%)及斯巴醇(3.25%)等。可推测甘松石油醚部位对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤起保护作用的活性成分可能为倍半萜类。甘松新酮作为甘松中的含量测定指标成分,具有热不稳定性,高温状态下易分解,因此采用HPLC方法测定甘松石油醚部位中甘松新酮的含量,结果表明甘松石油醚部位中甘松新酮含量为30.21%,为甘松石油醚部位中主要成分。4甘松新酮对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究MTT实验结果表明,SH-SY5Y细胞经6-OHDA损伤后,细胞活力明显降低(P<0.01)。与模型组相比,5μM甘松新酮预处理能减轻6-OHDA对细胞的损伤,细胞活力增强(P<0.05),10、20μM甘松新酮预处理,细胞活力明显增强(P<0.01)。单独不同浓度甘松新酮处理细胞对细胞活力无明显影响。细胞处理后置于倒置显微镜下观察,对照组细胞贴壁后生长良好,呈梭形、多边形或不规则的三角形。模型组细胞皱缩破损,胞体变圆、细胞数量减少。与模型组相比,甘松新酮给药后各浓度组细胞数量增多,细胞形态明显改善。LDH实验结果表明,经6-OHDA处理的模型组细胞膜通透性增加,细胞上清LDH活性显著增加。与模型组相比,5、10、20μM甘松新酮给药组,抑制细胞内LDH释放,上清中LDH活性显著降低。Hoechst33258染色后,正常组细胞核染色均匀,边缘光滑整齐。6-OHDA模型组细胞核可见致密浓染,显示亮蓝色荧光。甘松新酮保护组细胞核形态明显改善,趋于正常,细胞凋亡数量减少。细胞给药处理后,DCFH-DA荧光探针孵育细胞,流式细胞仪检测ROS水平,结果表明,与正常组细胞相比,6-OHDA处理组细胞ROS水平显著升高,经5、10、20μM甘松新酮预处理后,细胞ROS水平显著降低。5甘松新酮对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤保护作用的机制研究使用罗丹明123检测细胞线粒体膜电位情况,结果表明,与对照组细胞相比,6-OHDA处理组细胞线粒体膜电位降低,经甘松新酮预处理后,细胞线粒体膜电位水平得到恢复。采用Western Blot方法检测细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Caspase-3、Cleaved caspase-9及Caspase-9的表达水平,结果表明,与对照组相比,经6-OHDA处理的模型组细胞Bax/Bcl-2比值有上升的趋势、Cleaved caspase-3/Caspase-3、Cleaved caspase-9/Caspase-9的比值升高。与6-OHDA模型组相比,甘松新酮预处理细胞能够不同程度地降低上述比值,表明甘松新酮能够抑制线粒体凋亡途径从而发挥保护作用。采用Western Blot方法检测细胞MAPK通路相关蛋白p-ERK、ERK、p-p38、p38、p-JNK、JNK的表达水平。结果表明,与对照组相比,经6-OHDA处理的模型组细胞p-JNK/JNK的比值显著升高,p-p38/p38的比值有上升的趋势。甘松新酮预处理细胞后,p-JNK/JNK的比值降低,p-p38/p38的比值有下降的趋势,而对p-ERK/ERK的比值无明显影响。表明甘松新酮能够抑制JNK通路的激活,从而抑制细胞凋亡。结论综上所述,本课题建立了 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的体外PD模型,从细胞水平研究了甘松对其的保护作用。结果表明,甘松不同极性部位萃取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤有明显的保护作用,其中以石油醚部位保护作用最强,对其化学成分进行分析,主要含有以甘松新酮为代表的倍半萜类化合物。通过MTT检测、LDH释放、Hoechst33258染色及ROS检测等药效学方法,证明甘松新酮对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤有明显的保护作用,并通过Western Blot实验检测相关蛋白表达,证明了其作用途径可能是通过抑制JNK信号通路的激活,进而抑制细胞凋亡实现保护作用。通过以上研究,明确了甘松及甘松新酮对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及相关作用机制,为帕金森的治疗提供了新的方法和依据,也为甘松的进一步开发利用提供了实验依据。