目的:A族溶血性链球菌(GAS)是咽部、皮肤、软组织感染的常见致病菌,也是引起儿童中毒性疾病:猩红热、毒性休克综合征等的病原体,它的危害还在于可以导致感染后的自身免疫性疾病、风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎、牛皮癣以及免疫性脑病等。链球菌入侵人体后,机体最初的天然免疫也和抗其他多种病原体一样,主要是定居的巨噬细胞和招募来的嗜中性粒细胞的作用,一些研究已经描述了A族链球菌通过各种途径干扰中性粒细胞的抗微生物活性,包括释放分子干扰中性粒细胞的募集,诱导中性粒细胞死亡等,但是,A族链球菌如何逃避巨噬细胞强大的抗微生物作用国内外未有报道。本研究旨在探索GAS刺激RAW264.7巨噬细胞株后,对RAW264.7细胞的超微结构、细胞增殖,其表面分子的表达及其表达、分泌细胞因子等的影响,以进一步研究GAS的致病及其逃避免疫攻击的机制。方法:1将GAS分五个不同时间段刺激RAW264.7细胞,同时细菌刺激细胞数(MOI)分别设低菌量(2:1、5:1)、中等菌量(10:1、20:1、30:1)和高菌量(50:1、100:1),及PBS阴性和LPS阳性对照,均三复孔,作用完毕弃菌及加抗生素杀死胞外菌后,于细胞培养箱内继续培养三天,MTT法检测刺激前后RAW264.7的增殖情况。2以低菌量、中等菌量和高菌量GAS刺激细胞90min时,通过透射电子显微镜观察RAW264.7超微结构的变化,利用TUNEL和ANNEXIN V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。3分别用GAS、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以MOI为5:1时刺激巨噬细胞90min,作用完毕继续培养三天,行流式细胞术检测RAW264.7细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达情况;应用Real-time-PCR检测不同刺激组RAW264.7细胞的IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α、TGF-β等炎性细胞因子的转录水平变化,并通过ELISA检测刺激后细胞分泌IL-6的变化。4 Real-time-PCR法检测低菌量GAS刺激小鼠三天后,腹腔巨噬细胞及脾脏表达IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α、TGF-β的变化。结果:1 MTT结果显示,低、中菌量GAS对RAW264.7细胞增殖有促进作用,高菌量GAS对细胞增殖有抑制作用。2通过透射电子显微镜观察:低菌量细菌刺激细胞时,RAW264.7细胞的细胞器发达,功能旺盛,线粒体水肿,粗面内质网变粗糙;中剂量刺激时,细胞器发达,有髓样溶酶体结构,提示细胞吞噬消化细菌不完全;高菌量刺激细胞时,细胞出现空泡,核膜不完整等细胞坏死表象。3 TUNEL法和ANNEXIN V-FITC法结果均显示:高菌量刺激RAW264.7时,细胞数减少是由于细胞坏死而不是凋亡。4半定量PCR及Real-time-PCR结果显示:低菌量GAS刺激RAW264.7时,细胞表达IL-1、IL-23及TNF-α基因水平升高,而IL-6、TGF-β水平下降。5以低菌量GAS、大肠杆菌金和黄色葡萄球菌刺激巨噬细胞,与对照组相比,各刺激组细胞表达CD80分子均升高,且大肠杆菌升高最为显著,其次分别为金黄色葡萄球菌、GAS;大肠杆菌刺激组CD86表达水平升高,其余刺激组表达无明显变化;GAS刺激组细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达无显著变化,但大肠杆菌与金葡菌刺激组表达升高,且有统计学意义。Real-time-PCR结果显示:大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激组RAW264.7表达IL-6等细胞因子的转录均增加,并且大肠杆菌刺激组升高明显,GAS刺激组IL-6转录反而下调。6通过Real-time-PCR检测,与对照组比较,低菌量GAS刺激小鼠后,小鼠腹腔巨噬细胞表达IL-1、TNF-α水平升高,IL-6、IL-23、TGF-β变化不明显;小鼠脾细胞表达IL-1、IL-6、IL-23、TNF-α、TGF-β水平均增高。结论:1低菌量GAS作用RAW264.7细胞:能够促进其增殖,使其吞噬功能活跃,其表达促炎症因子的基因水平升高,但使其IL-6、TGF-β表达水平下降,相关机制、信号转导通路等仍有待研究。2低菌量GAS、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌能促进RAW264.7细胞表面CD80、MHC-Ⅱ分子表达,说明在一定程度上能增强巨噬细胞的抗原递呈作用,但GAS的这种作用不明显。3高菌量GAS对细胞增殖有抑制作用,使巨噬细胞坏死而不是凋亡。