慢性感染性疾病以及恶性肿瘤严重威胁着当今世界人类的健康。近年来虽然出现了众多抗感染药物,对肿瘤的发病机制也从细胞水平到分子水平有了更为深入的认识,同时肿瘤靶向药物和小分子抑制剂的应用也取得了一定程度的临床疗效,然而在治疗过程中仍然存在着各种需要改善的问题,如何提高慢性感染性疾病以及恶性肿瘤的临床治疗效果已经成为亟待解决的重要问题之一。慢性乙型肝炎在世界范围内,尤其在亚洲地区,感染者数目仍然很多。目前治疗慢性乙型肝炎的药物主要分为干扰素和核苷或者核苷酸类似物等。然而在临床治疗过程中发现,只有干扰素才能够在部分乙肝患者中达到清除HBsAg及HBeAg的效果,其机理有很多,主要认为可能是通过STAT1分子向下游传递信号,从而诱导干扰素刺激基因的表达。因此对于干扰素应答与不应答患者之间的免疫学机制研究,从而寻找能够提高干扰素疗效的策略,已经成为关注的重要问题。T细胞与自然杀伤细胞(NK细胞)对抗病毒感染等起着至关重要的促进作用,但在慢性感染过程中,T细胞和NK细胞往往处于功能耗竭的状态。细胞因子IL-2对多种免疫细胞有着活化与扩增的作用,而且曾经应用于多种肿瘤的临床治疗。但是对于继干扰素使用后能否再序贯使用IL-2治疗尚未见报道。考虑到干扰素以及IL-2下游均能够通过STAT1分子传递信号,所以针对经过干扰素治疗后无效的慢性乙肝患者,能否序贯使用IL-2从而起到协同提高T细胞和NK细胞的免疫应答能力?该方法是否适合应用于乙肝患者的临床治疗?能否有利于提高临床治疗效果?我们主要针对上述三个问题,对经干扰素治疗无应答的乙肝患者展开临床试验研究。由慢性乙型肝炎逐渐进展,可能发展为肝硬化,最终进展为肝癌。而目前针对肝癌的药物并不多且效果并不理想,无论免疫卡控点治疗还是索拉菲尼,都无法显著延长患者生存期。手术一直是肝癌治疗的主要方式之一,但是手术也存在着很大的风险,即术后易于原位复发。肝脏本身具有强大的术后再生能力,IL-6家族成员均可通过STAT3向下游传递信号,促进肝脏再生,同时有报道认为IL-11与肝切除后肝脏细胞的代偿性增生有关,IL-11-STAT3信号通路对于结直肠癌的发生起到至关重要的作用。因此术后的再生过程是否也伴随或者促进了肿瘤的生长?IL-11-STAT3信号是否起到促进肝癌生长的作用?能否寻找一种行之有效的方式抑制肝癌术后的复发?围绕着这三个问题我们对于肝癌的术后展开了研究。本文主要从寻找提高无应答乙肝患者治疗临床效果和防止肝癌术后复发两个方面展开研究,获得了如下结果。Ⅰ.序贯使用IL-2可提高经干治疗无效的患者抗病毒应答能力通过第一项临床试验,我们选取了 92例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者。接受48周的标准长效干扰素治疗,并进行24周的随访。我们对入组的患者及正常人对照组的PBMC进行了系统的临床特征及免疫学分析,发现干扰素治疗为IL-2治疗提供了基础。继而我们通过第二项临床试验,对于经干扰素治疗无效的患者进行24周的序贯IL-2治疗。通过使用流式细胞术、ELISA、免疫荧光、western blotting、RTCA及相关性分析等,发现了序贯使用IL-2治疗能够提高临床治疗效果的机制。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.干扰素治疗后大多数患者为无应答患者,且IL-2Rα在CD4+T细胞表达降低通过分析经干扰素治疗后患者免疫学指标及临床指标,发现经过干扰素标准化治疗后多数患者为无应答患者,HBeAg未能转阴。IL-2R发生了显著变化,尤其IL-2Rα在CD4+T细胞表达显著下降。同时NK细胞表面的IL-2Rβ及IL-2Rα的表达在干扰素治疗后显著升高。总之,IFN-α治疗后,IL-2R主要传递正向免疫信号,从而为序贯IL-2治疗做铺垫。2.体外使用IL-2刺激可提高无应答患者T细胞及NK细胞的效应功能。当体外使用IL-2刺激从无应答患者外周血分离出的PBMC后,发现可以显著提高该部分患者T细胞及NK细胞的抗病毒效应功能,使产生IFN-γ及TNF-α的能力显著增强。CD38、NKG2D等活化分子表达升高,同时并未升高负调分子如PD-1,Tim-3的表达,且Treg细胞比例也未见升高。3.使用IL-2刺激可提高CHB患者肝脏组织淋巴细胞的效应功能。通过从乙肝患者肝穿组织分离的淋巴细胞进行IL-2体外刺激,发现不仅可以上调活化分子CD38、NKp30的表达,同时可以提高IFN-γ在淋巴细胞中的表达。4.体内经IL-2序贯治疗后不升高负调分子表达。通过对无应答患者进行IL-2治疗后检测发现,Treg细胞比例及PD-1分子表达均未见升高,反而有所下降。IL-2Rβ在NK细胞的表达显著升高。5.序贯IL-2治疗后增加p-STAT1表达同时下调p-STAT5表达通过western blotting检测发现对于体外使用IL-2刺激的无应答乙肝患者PBMC,p-STATl表达升高,p-STAT5表达下降。通过流式细胞术检测,经IL-2治疗后的患者,CD4+T细胞中p-STAT5表达下降。通过免疫荧光检测发现,淋巴细胞中的p-STAT1表达呈现出显著增加。6.使用IL-2治疗显著提高CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-γ。通过对不同时间点动态检测发现,经干扰素治疗无效的患者在IL-2治疗后,CD8+T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α及CD107a的水平显著升高。对患者治疗前后的血清进行比较,发现IFN-γ,IFN-αα水平在治疗后显著升高,而IL-10水平则保持稳定。7.使用IL-2治疗显著提高HBV特异性CD8+T细胞比例及杀伤作用。通过对不同时间点动态检测发现,在IL-2治疗后,pentamer+CD8+T细胞比例显著升高,此外CD44+CD62I-CD8+T细胞比例以及NKp30表达也有着显著升高。pDC细胞及CD80、CD86分子的表达也是呈现出显著增多。继而通过RTCA检测发现,从经IL-2治疗后的患者PBMC中分离出的CD8+T细胞具有更强的杀伤PLC/PRF/5细胞的功能。8.体内IL-2治疗可提高临床治疗效果通过对入组的23例患者临床资料分析发现,HBeAg水平在干扰素治疗前后未发生显著变化;然而经IL-2治疗后,HBeAg水平则显著下降。同时有5位患者HBeAg转阴,此外一位患者HBsAg转阴且伴有抗体的产生。对于免疫学指标与HBeAg进行相关性分析发现,pentamer+CD8+T细胞比例及 IFN-γ+CD107a+CD8+T细胞比例与HBeAg呈现明显负相关关系。9.CD24+CD38hiB细胞负调IFNα治疗效果然而并非所有乙肝患者经干扰素治疗后都适合序贯IL-2治疗,因此对于这部分患者则可能需要其他治疗策略。在研究过程中,除上述结果外,我们还发现了CD24+CD38hiB细胞比例及数目随干扰素的治疗呈现出动态增加,且CD24可作为CD24+CD38hi B细胞的标志分子。CD24+CD38hi B细胞可分泌高水平IL-10从而负调免疫应答。通过分选去除CD24+CD38hi B细胞后,则可以提高T细胞及NK细胞产生IFN-y及TNF-α的能力。最后通过构建的HBV小鼠模型使用anti-CD24抗体联合干扰素治疗,发现与单独干扰素治疗相比,发现可显著促进HBeAg及HBsAg的下降。综上所述,本研究表明虽然CHB患者经干扰素治疗后多数呈现无应答状态,但是CD4+T细胞表面的IL-2Rα表达下降,并且IL-2的高亲和力受体IL-2Rαβy表达降低,从而限制了 IL-2通过其下游STAT5分子磷酸化诱导FOXP3的表达,进而抑制了负向免疫应答。而序贯使用IL-2治疗后,则能够通过升高IL-2中亲和力受体IL-2Rβγ表达、促进STATI分子磷酸化,同时降低STAT5磷酸化,发挥正向免疫应答效应,包括提高CD8+T细胞和NK细胞的效应功能,以及pentαmer+CD8+T细胞比例等。与此同时,并不增加免疫负调分子表达及FOXP3+Treg细胞的比例。这些机制最终促进了抗病毒应答能力,并一定程度上促进了 HBeAg或HBsAg的清除。因此序贯IL-2的治疗对提高临床使用干扰素之后的HBeAg转阴率具有重要意义。而对于不适合序贯使用IL-2治疗的患者,anti-CD24抗体治疗或许又是一个有前景的、可供选择的方案。Ⅱ、肝切除通过IL-11-STAT3信号途经促进肝癌术后复发通过使用原位接种肿瘤模型,化学诱导致癌模型,原位移植瘤模型,研究手术对肿瘤的影响。通过基因芯片分析及基因敲除鼠验证IL-11是否对肿瘤生长起到促进作用。最后通过小分子抑制剂证明其能够有效的防止术后复发。本研究通过上述研究方案得到了以下结果。1.肝癌术后可复发通过对不同国家的不同肿瘤术后五年复发率进行研究,发现肝癌在不同国家中术后复发率都很高。继而通过将肝癌模型小鼠的肿瘤切除后,发现确实可以术后复发。术后存在着更显著的PCNA和CD31的表达。2.肝切手术促进肿瘤生长通过肝损及部分切除后构建小鼠肝癌模型,发现肿瘤生长更为迅速。与对照组相比,手术损伤组小鼠肝脏纤维化程度更为严重,PCNA和CD31的表达更强。通过核磁拍照也同样证明经过手术切除部分肝脏再构建的肝癌模型,肿瘤生长更为致密,更为严重。3.术后肝脏局部IL-11表达升高通过对肝癌患者肿瘤组织及癌旁组织进行基因芯片分析,发现IL-11在肿瘤组织中显著高表达。而IL-6在癌和癌旁中的表达水平均较高。通过对肝切后不同时间点的小鼠肝脏进行组化及ELISA检测,也发现IL-11在肝切后显著升高。最后通过GEO数据库,对374例肝癌组织与50例癌旁组织进行基因分析,发现仍然IL-11在肝癌组织中呈现出显著性高表达。4.IL-11信号对肝癌术后复发是必须的通过对Il-RaαKO鼠研究,我们发现当小鼠敲除IL-11信号后,可显著减缓肝癌术后的复发。无论肿瘤数目、重量,PCNA、AFP及p-STAT3表达均显著低于对照组。说明IL-11信号对肿瘤术后的复发是必要的。5.抑制IL-11信号可促进肿瘤细胞凋亡通过体外使用IL-11刺激Hepa1-6细胞后,发现可以促进细胞增殖。当使用STAT3抑制剂Napabucasin阻断IL-11-STAT3信号后,则细胞发生明显凋亡。通过流式检测发现抑制IL-11信号后,7AAD+细胞比例显著增多;通过免疫荧光检测发现当使用Napabucasin处理细胞后,PCNA的表达显著降低。通过western blot检测发现在使用Napabucasin处理后,无论是否在细胞培养条件中加入IL-11或IL-6,细胞的p-STAT3表达都受到了显著抑制。6.Napabucasin可抑制术后复发通过使用Napabucasin治疗肝内接种肿瘤细胞后的小鼠,发现可以有效抑制肿瘤的生长。且HE染色发现肝脏病理损伤较轻,同时组化染色发现PCNA表达显著降低。继而通过术后复发模型,即手术切除肝脏肿瘤后再给小鼠注射Napabucasin,同样发现肿瘤生长受限。7.IL-6对肝癌术后复发不是必要因素我们发现Il-6KO鼠在接种肿瘤细胞后,可以正常成瘤。当手术切除肿瘤后能够正常复发。但在术后给予Napabucasin治疗则显著抑制复发。无论肿瘤大小、数目、重量以及PCNA表达都显著降低。8.抑制STAT3磷酸化可抑制IL-11对肿瘤生长的促进作用通过对WT鼠接种肝癌细胞系后,再给小鼠注射IL-11则能够显著促进肿瘤生长,而一旦使用Napabucasin治疗,则显著抑制肿瘤。同时发现当小鼠加入使用IL-11后肝脏纤维化程度加重,PCNA及AFP表达升高;而当使用Napabucasin治疗后,则显著抑制肿瘤生长,纤维化程度减弱,PCNA及AFP表达也明显受到抑制。此外,对DEN诱导的自发肝癌组织再经过同种异体移植后,发现经过手术切除肝脏肿瘤后,肿瘤依旧可以复发。然而在术后给予Napabucasin治疗后,则明显该模型中肝癌的术后复发。PCNA及p-STAT3的表达也相应的显著降低。综上所述,本研究表明在肝癌环境下,将肝脏肿瘤切除后,肝脏再生的过程中产生的细胞因子IL-11可通过IL-11-STAT3信号途径促进肿瘤生长,因此肝再生的同时也伴随了肝癌的复发。而对于肝癌患者又无法不进行手术,因此在术后联合使用如STAT3抑制剂Napabucasin可能起到较好的防止肝癌复发的作用,具有潜在的临床意义。