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目的:甲状腺激素(TH)是哺乳动物脑发育过程中的关键物质,其在发挥作用的过程中与同源盒基因Nkxs具有相关性,我们之前实验已经证明Nkxs参与了低TH导致的脑发育迟滞,根据文献报道,TH、Nkx6.1各自与Shh信号通路具有一定联系,故本实验将Nkx6.1、Shh作为研究对象,选取中枢神经系统中数目最多的星形胶质细胞作为研究载体,旨在观察Shh是否参与了甲状腺激素对Nkx6.1的作用,为进一步深入研究甲状腺激素影响同源盒基因NKx6.1的具体表达机制奠定基础。方法:本实验利用细胞原代培养法,从新生鼠大脑皮层中得到所需星形胶质细胞,采用恒温摇床振荡和差速贴壁的方法进行细胞纯化,倒置显微镜观察细胞形态数目变化,采用细胞免疫荧光法进行星形胶质细胞的鉴定及纯度检测,将细胞进行脱激素处理,分为三组培养,低激素组:含1%ITS-M、2%FBS及双抗的RPMI1640培养细胞,正常组:含10%FBS和双抗的RPMI1640培养基培养细胞,高激素组:含终浓度为10-7M T3的RPMI1640培养基培养细胞,每组分别分三个时间段进行培养,12h、24h、48h,收集细胞,提取总RNA进行纯度鉴定。设计引物,实时定量PCR检测不同时间点、不同激素水平下Shh、NKx6.1m RNA水平变化,制备蛋白样品,Western Blot检测Shh、NKx6.1蛋白表达。使用内源性Shh抑制剂(环杷明Cyclopamine)培养细胞12h、24h、48h,定量PCR、Western Blot检测不同激素水平、不同时间点NKx6.1的表达情况。结果:原代培养细胞置于倒置显微镜下观察,星形胶质细胞在初次种植24h后,大部分细胞均已贴附于培养瓶底,部分细胞开始铺展,胞体呈圆形,折光性高,细胞体积较小,培养第4-5d时,细胞体积明显增大,部分生长迅速的细胞胞体伸展,随着培养时间延长,细胞数量明显增多,胞体增大,培养物中星形胶质细胞的比例逐渐增多,位于底层;培养9-12d,细胞基本铺满整个培养瓶且以星形胶质细胞为主,细胞密集排列生长,胞体体积达到最大;将细胞进行传代后生长更活跃,培养4-6d即可铺满瓶底。细胞进行纯化培养后,星形胶质细胞形态更加突出,比例更高,利用GFAP细胞免疫荧光法进行细胞鉴定,每张盖玻片取十个视野进行阳性细胞计数,抗体标记阳性星形胶质细胞纯度大于95%。实时定量PCR、Western Blot检测Shh、NKx6.1变化,结果表明,正常组中Nkx6.1无明显变化,只是在48h的时候有一表达小峰;低激素组12h、24h培养时间里Nkx6.1无明显变化,与正常对照组相比差异不具有显著性(P>0.05),在48h表达量突然下降;高激素组培养12h、24h后Nkx6.1水平显著升高,在48h表达量突然下降且与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。另一方面,对照组Shh水平在所测时间里并无明显变化;低激素组12h、24h、48h培养时间里Shh水平均显著下降,其中48h下降程度最大;高激素组培养12h、24h Shh水平显著升高,而在48h表达量降低且明显低于对照组。Shh与Nkx6.1相关性研究表明,抑制Shh后Nkx6.1水平随作用时间延长而下降,且与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。结论:利用原代培养,成功获得纯度较高的星形神经胶质细胞,证实了不同剂量的甲状腺激素作用不同时间对Shh、Nkx6.1具有不同的影响,且Shh和Nkx6.1变化水平相近,通过进一步抑制Shh信号通路,发现NKx6.1表达下调,综上初步证实Shh参与了甲状腺激素对NKx6.1的作用过程,其很可能成为揭示该过程机制的关键因子。