贾第鞭毛虫是一种引起宿主腹泻的人畜共患的寄生原虫,其引起的贾第虫病在多地暴发流行。该病的症状有腹泻、脱水、腹痛、恶心、呕吐、体重减轻等。全世界每年有近2.8亿人被感染。除感染人之外,还感染家畜(牛、羊、猪、兔等)、野生动物(狐狸、狼、袋鼠、骆驼等)、和宠物(猫、犬、龙猫等)。该病的流行会给畜牧业造成严重的公共卫生问题和经济损失。因此对贾第虫病进行快速、准确的诊断对畜牧业卫生安全具有重要意义。十二指肠贾第虫寄生在宿主的小肠粘膜上皮,是一种厌氧型原生动物寄生虫。它具有真核生物和原核生物的特性,同时也有自己的生物学特点,因而贾第虫是细胞生物学和生物进化很有意义的研究对象。荧光标记方法可以用于贾第虫的生物学研究,将遗传水平上的相关活动可视化。常用的贾第虫标记荧光素GFP和SNAP标签,在贾第虫的应用上都存在着限制。分选酶A是一种新兴可用于在活细胞中或体外进行蛋白质修饰标记的转肽酶,广泛应用于生物技术领域。本实验室前期研究发现贾第素α-12具有特异性和高表达量,并已应用于建立间接ELISA检测方法中,因此,本实验拟基于贾第素α-12建立一种贾第虫荧光标记方法和PCR检测方法。主要研究内容如下:基于贾第素α-12的贾第虫标记方法的建立,首先进行贾第虫体外贾第素α-12和荧光染料的连接:对SortaseA蛋白进行表达、纯化、浓缩,检测其活性。构建了pET-28-giardin-α-12-LEPTG表达载体,表达纯化后,得到分子量约为36kDa大小的giardin-α-12-LEPTG蛋白。将得到的SortaseA、giardin-α-12-LEPTG和polyG(GGG)-GFP(约26kDa)共孵育,经SDS-PAGE分析鉴定,成功得到了与理论值一致大小分子量约62kDa的giardin-α-12-LEPTGGG-GFP结合蛋白。成功实现了在贾第虫体外贾第素α-12和荧光染料的特异性结合。在贾第虫体内荧光标记方法的实验:成功地重组构建了十二指肠贾第虫病毒载体pC631-giardin-α-12-LEPTG-pac,将其进行体外转录电转染入到十二指肠贾第虫体内,获得具有潮霉素抗性的十二指肠贾第虫目的虫株。扫描电镜观察目的虫株的形态结构良好和生长曲线无变化,成功获得稳定传代20代以上的目的虫株。通过Real-time PCR检测该虫株可高表达giardin-α-12-LEPTG,成功得到了可以稳定表达giardin-α-12-LEPTG的虫株。将目的虫株与SortaseA、polyG-FITC共孵育,成功在激光共聚焦下观察到具有荧光标记的贾第虫。该标记方法也成功印证了贾第素α-12在贾第虫体内的细胞定位。基于贾第素α-12的贾第虫PCR检测方法的建立,根据NCBI中的贾第素α-12基因序列,选择高度保守的基因片段设计合成引物,优化反应条件,选择该PCR方法的退火温度和延伸时间,验证该方法的特异性和敏感性。结果显示该反应最佳的为退火温度62℃,延伸时间30s,特异性好。敏感性验证结果显示最低可检测每克样品中2×10~1个十二指肠贾第虫包囊。应用已建立的基于贾第素α-12的贾第虫PCR检测方法检测来自长春周边养殖场的羊粪便样品283份,检出十二指肠贾第虫阳性率为13.7%(39/283),基因型均为聚集体A。综上所述,本研究成功建立了贾第虫的荧光标记方法和PCR检测方法,为了解和认识贾第虫更多生物学相关功能提供了实验思路和技术手段,为进一步对贾第虫的诊断和防控提供了基础。