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核酸分析技术已被广泛应用于食品安全、医疗诊断、环境监测等领域。传统核酸分析方法需要昂贵的仪器、复杂的操作、专业的人员,主要应用于专业的实验室。为了开发简单、低成本、操作便利的核酸分析方法,本课题以常见致病微生物为研究对象,以环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）为扩增方法,以规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及Cas12a蛋白构建的基因编辑系统作为扩增产物检测手段,依次建立了利用离心式芯片、旋转阀芯片和聚丙烯塑料袋耦合CRISPR/Cas12a系统的集成核酸检测方法,使核酸分析过程变得更加简便,同时又能保证高灵敏度和高特异性,促进核酸分析技术在基层等资源有限地区的发展及其在农业食品安全中的应用。本文的主要内容和研究结果如下:1)针对LAMP反应产物的检测建立并优化了CRISPR/Cas12a检测体系,设计了能够特异识别目标核酸片段的引导RNA序列（guide RNA,g RNA）。通过对CRISPR/Cas12a检测体系中Cas12a蛋白、g RNA、单链DNA探针（ss DNA-FQ）、镁离子等成分的浓度与配比进行优化,成功构建了基于CRISPR/Cas12a系统对LAMP反应产物进行终点荧光可视化检测的方法,并考察了该方法的检测灵敏度与特异性。结果表明:LAMP反应结合CRISPR/Cas12a系统能够对目标DNA进行特异性地检测。优化后的CRISPR/Cas12a检测体系组成为200 n M Cas12a蛋白、600 n M g RNA、2.5μM ss DNA-FQ、0.5 U/μL RNA酶抑制剂、1×NEBuffer2.1,其中镁离子浓度保持在10-12 m M。通过与凝胶电泳和熔解曲线分析方法进行对比,该方法在检测低浓度LAMP反应产物时仍能在短时间内产生高强度荧光信号。综上可知,CRISPR/Cas12a检测体系能够快速、特异、灵敏地对LAMP反应产物进行检测,有望替代传统凝胶电泳或熔解曲线分析方法。2)为简化核酸分析操作过程,建立了离心式芯片耦合CRISPR/Cas12a的集成核酸检测方法。该芯片借助三个可逆旋转微阀以及基于离心产生的科里奥利伪力,来实现对液体流动顺序和方向的准确控制。利用商业化的旋涂仪实现芯片的离心,采用硅胶膜捕获核酸分子。将该方法用于检测副溶血性弧菌,以不耐热溶血素（Thermolabile hemolysin,tlh）基因为靶标,构建LAMP反应体系,并设计合适的g RNA序列用于CRISPR/Cas12a检测体系,实现扩增产物的荧光可视化检测。结果表明:该方法以0.5 M异硫氰酸胍（Guanidinium isothiocyanate,GITC）和4 M Na Cl为裂解试剂、25%的乙醇为清洗试剂、无核酶水为洗脱试剂,可以实现最优核酸提取。阳性样品在5 min内产生绿色荧光信号而阴性样品无荧光信号产生。以纯培养的副溶血性弧菌和加标对虾样品为检测对象,检测灵敏度可达120 copies/reaction,整个检测在50 min内完成。综上可知,该方法通过离心式芯片实现核酸分析,整体结构简单,不需要进行复杂的流道设计以及使用专业检测仪器,为发展简便集成核酸分析方法提供了新思路。3)针对上述离心式芯片构建的核酸分析方法需借助离心装置使得操作不便以及核酸纯化过程不能完全去除残留杂质的问题,建立旋转阀芯片耦合CRISPR/Cas12a的集成核酸检测方法。该芯片利用旋转阀和注射器完成液体在不同腔室之间的转移以及液体在腔室内的搅拌,借助磁球对核酸进行捕获。整个核酸提取操作模拟实验室基于磁球的手工核酸提取过程。通过设置洗涤腔室和空气腔室来去除核酸纯化过程中残留的杂质。将该方法用于检测副溶血性弧菌,利用上一章节优化的LAMP反应体系和CRISPR/Cas12a检测体系对tlh基因进行扩增和检测。结果表明:该方法能够在芯片上精准实现液体转移与搅拌,无需使用离心装置。通过对PCR扩增曲线与产物熔解曲线分析,核酸纯化过程中的残留乙醇等杂质能够被有效去除。以纯培养的副溶血性弧菌和加标对虾样品为检测对象,检测灵敏度可达31 copies/reaction,整个检测在80 min内完成。综上可知,该方法整个操作过程无需使用专业仪器,极大降低了检测成本,且能够获得高质量核酸提取物,极具应用于基层核酸分析的潜力。4)针对上述旋转阀芯片构建的核酸分析方法操作步骤较繁琐、需反复移液等问题,建立聚丙烯塑料袋耦合CRISPR/Cas12a的集成核酸检测方法。该方法利用外部磁铁带动溶液内磁球穿过水/油相界面依次进入不同腔室完成整个核酸纯化过程,无需移液,并通过按压塑料袋实现磁球与溶液的均匀混匀,操作简单。将该方法用于检测沙门氏菌和新型冠状病毒,以沙门氏菌侵袭蛋白A（Invasion protein A,inv A）基因和新型冠状病毒开放阅读框（Open reading frame,ORF）基因为靶标,分别设计了LAMP与反转录LAMP（Reverse transcription-LAMP,RTLAMP）引物,并筛选出合适的g RNA序列用于CRISPR/Cas12a检测体系。为进一步提高检测结果的可靠性,结合双重RT-LAMP反应,开发了一种基于CRISPR技术的伪双重核酸分析方法,能够产生阳性、阴性或无效检测三种结果。结果表明:该方法能够以简单的操作获得高纯度核酸,借助小型紫外灯即可实现结果判读,整个检测在60 min内完成,无需专业仪器辅助。以沙门氏菌和新型冠状病毒为靶标,检测灵敏度分别为16 CFU/reaction与20 copies/reaction。综上可知,该方法检测成本低、操作简单、结果可靠性高,将有利于推动核酸分析技术在农产品安全检测及其相关领域中的应用。