布鲁氏菌病(Brucellosis)是由感染人和动物的布鲁氏菌(Brucella)造成的对社会安全有严重危害的人畜共患病,特别是在经济较为落后的国家。布鲁氏菌是一类兼性胞内寄生菌,其能促进自噬发生和逃避溶酶体的融合,获得在宿主内的复制和繁殖的能力。IV型分泌系统(Type IV secretion systems,T4SS)是布鲁氏菌关键的毒力因子之一,其在机体与布鲁氏菌相互作用中能分泌多种效应蛋白。已有研究确定了11种布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白,其中Tcp B、Cst A和Ric A的功能较清楚,但其他T4SS效应蛋白的毒力表型及其调控机制还尚不清楚。本研究以布鲁氏菌T4SS效应蛋白基因DK63-887、BMEI1135为研究对象,通过探讨其对胞内布鲁氏菌存活能力的影响及与布鲁氏菌介导的自噬、逃避溶酶体融合的影响,为揭示细菌在宿主细胞内持续性感染的分子机制提供依据,同时为相关疫病的预防、控制工作奠定理论基础。目的:本研究以羊种布鲁氏菌参考株16M为研究对象,探讨T4SS效应蛋白基因DK63-887、BMEI1135的功能及其在布鲁氏菌致病过程中的作用机制。(1)构建DK63-887、BMEI1135基因的突变株,初步分析其生存能力。(2)探讨IV型分泌系统效应蛋白DK63-887、BMEI1135基因对羊种布鲁氏菌16M介导细胞自噬的影响。(3)初步探究IV型分泌系统效应蛋白DK63-887、BMEI1135基因对羊种布鲁氏菌16M逃避溶酶体融合的影响。方法:(1)以16M为模板来分别扩增DK63-887、BMEI1135基因的上下游同源臂,以p UC19K质粒为模板扩增卡那霉素抗性基因;采用融合PCR和抗性替换技术,将以上片段融合,并连接载体p MD18-T Simple,构建突变载体;之后将其电转化至16M感受态细胞内,进行PCR鉴定。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887、16MΔBMEI1135在相同条件下震荡培养,观察其生长趋势变化以及置于不同应激环境中观察其生存率;将各菌株侵染以100:1的MOI小鼠巨噬细胞RAW264.7,在不同时间点分析其在胞内的存活能力;用106CFU剂量腹腔注射接种BALB/c小鼠,分析其在体内生存能力。(2)布鲁氏菌侵染巨噬细胞RAW264.7 24 h后,利用投射电镜观察自噬泡的数量;利用实时定量PCR和Western blot分别检测自噬ULK1、Beclin1基因m RNA和蛋白的表达;亲本株和突变株侵染稳定表达p EGFP-LC3的小鼠巨噬细胞12 h,利用共聚焦显微镜观察自噬点形成情况。(3)构建能够表达绿色荧光的布鲁氏菌,侵染巨噬细胞RAW264.7,在24 h时用红色探针分别对溶酶体、高尔基体、内质网染色,利用激光共聚焦观察布鲁氏菌分别与溶酶体、高尔基体、内质网的共定位情况。结果:(1)成功构建了T4SS效应蛋白DK63-887、BMEI1135基因的突变株116MΔDK63-887、16MΔBMEI1135,在20代内遗传性稳定;突变株和亲本株的体外生长趋势相符合;体外刺激结果显示,突变株对酸、碱、高盐、热应激、营养缺陷和干燥的抵抗力降低;在感染小鼠巨噬细胞4、12、24和48 h时,突变株在胞内存活能力和突变株免疫小鼠第4-10周,小鼠脾脏载菌量的均极显著低于亲本株16M组(P<0.01);(2)细胞自噬结果发现在12 h时16MΔDK63-887、16MΔBMEI1135组的绿色荧光颗粒显著降低(P<0.01);在24 h时突变株组细胞中Beclin1和ULK1 m RNA相对表达量和蛋白水平均显著低于16M组(P<0.01);与亲本株16M相比较,突变株组中细胞包含自噬泡也明显减少(P<0.01);(3)亲本株和突变株侵染细胞24 h时突变株组胞内的布氏小体与溶酶体共定位比例明显升高(P<0.01),而与高尔基体、内质网共定位的比例较亲本株16M均极显著减少(P<0.01)。结论:(1)IV型分泌系统效应蛋白DK63-887、BMEI1135基因缺失之后,可显著降低16M在宿主体内和体外的存活,从而可提高宿主的细胞免疫抵抗16M感染;(2)DK63-887、BMEI1135基因缺失之后可显著抑制16M介导的RAW264.7巨噬细胞自噬。(3)DK63-887、BMEI1135基因缺失之后利于16M与溶酶体的融合,降低其到达高尔基体及内质网场所的菌量。