论文部分内容阅读
研究背景肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上最为常见的肿瘤之一,其死亡率极高,肝细胞肝癌患者占所有肝癌患者的90%。导致肝癌患者预后差的主要原因是复发及转移。针对改善肝癌生存的治疗策略尚未取得满意的效果。因此,进一步阐明肝癌信号通路在恶性肿瘤调控中的作用,可能有助于发现肝癌治疗中新的有效分子靶点。RhoGAPs(RhoGTPase-activating proteins,RhoGTP酶活化蛋白)可以增加RhoGTPases固有的水解活性,导致RhoGTPases水解加速而失活。RhoGAPs常常在肿瘤中低表达,普遍参与调控细胞的增殖及迁移。RhoGAPs是一种新的癌症生物标志物,DLC-1/2、STARD13在肝癌中低表达,PIK3R1在前列腺癌中低表达,β-chimerin在乳腺癌中低表达,ARHGAP8在结肠癌和乳腺癌中低表达,ARHGAP20在白血病中低表达。因此,主流观点认为RhoGAPs发挥抑癌作用。然而,最近的研究显示ARHGAP11A在结肠癌及乳腺癌中高表达且发挥促癌作用,与传统观点不一致。在结肠癌及乳腺癌中,ARHGAP11A通过依赖于RhoA途径促进细胞的转移及增殖能力而在肿瘤中起到重要作用。目前关于ARHGAP11A与肝癌的研究鲜有报道,其在肝癌中的作用机制是否依赖于RhoA有待进一步研究。目的明确ARHGAP11A在肝癌中的表达以及临床意义,在体内外探讨ARHGAP11A对肝癌恶性进展的影响,阐明ARHGAP11A在肝癌中的作用机制。方法1.通过TCGA数据库分析ARHGAP11A在肝癌中的表达与临床病理特征和预后之间的关系。采用RT-PCR方法验证TCGA数据库数据,在75例肝癌患者检测ARHGAP11A的表达情况,并分析其表达情况与临床病理特征之间的关系。2.利用sh RNA抑制ARHGAP11A在Hep3B及MHCC97-H中的表达;通过CCK-8和平板克隆实验ARHGAP11A对细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析ARHGAP11A对细胞周期及凋亡的影响;采用Transwell及划痕实验探讨ARHGAP11A对细胞侵袭及迁移的影响;采用免疫印记检测EMT相关标志物。3.利用裸鼠皮下成瘤及C57BL小鼠转移瘤实验探讨ARHGAP11A对肿瘤生长及转移的影响。4.基因芯片结合IPA分析ARHGAP11A在肿瘤中功能及潜在下游基因,利用RT-PCR和Western-Blot对芯片结果进行验证。5.通过si RNA在肝癌细胞中抑制RAC1B表达,研究RAC1B对肝癌细胞侵袭、迁移及EMT的影响;通过挽救实验探讨ARHGAP11A在肝癌的发挥作用是否由RAC1B介导。6.通过免疫共沉淀、质谱分析及GST pull down实验阐明ARHGAP11A调控RAC1B的机制。结果1.在TCGA数据库中ARHGAP11A在肝癌中的表达显著高于癌旁组织,其表达水平与临床分级、TNM分期、病理分级相关;生存分析发现患者中ARHGAP11A表达较低者预后较好,表达较低者中位生存期为2131天而表达较高者中位生存期为1149天。在75例肝癌患者样本中ARHGAP11A的表达与患者肿瘤大小、肿瘤分化、转移及TNM分期相关;与患者性别、年龄、血清AFP无关。2.RT-PCR及免疫印记均证实:在Hep3B和MHCC97-H细胞中ARHGAP11A-sh RNA能显著抑制ARHGAP11A的表达水平。3.CCK-8及平板克隆实验提示:抑制ARHGAP11A后,细胞增殖能力减弱。细胞周期及凋亡分析提示:抑制ARHGAP11A后,细胞发生G1/S期阻滞,对凋亡无明显影响。Transwell及划痕实验提示:抑制ARHGAP11A后,细胞侵袭迁移能力降低。当ARHGAP11A下调后,细胞由间质样表型变为上皮样表型,E-cadherin表达增加,N-cadherin及snail表达减少。4.裸鼠皮下成瘤及C57BL小鼠转移瘤实验证实:ARHGAP11A表达减少能抑制肿瘤的生长及转移。5.基因芯片结果提示:在Hep3B细胞中下调ARHGAP11A表达后,255个基因表达上调,179个基因表达下调,许多调控细胞增殖的基因表达下调。IPA分析提示:抑制ARHGAP11A表达后,可抑制参与调控细胞发育、生长、增殖、运动等的信号轴。6.抑制RAC1B在肝癌中的表达导致细胞的侵袭迁移能力降低,同时,E-cadhrin表达增加,N-cadherin及snail表达减少。ARHGAP11A在肝癌中的作用由RAC1B介导。7.免疫共沉淀及质谱分析提示:ARHGAP11A与RAC1B相互作用,但不影响RAC1的泛素化。GST pull down实验提示:在Hep3B细胞中,抑制ARHGAP11A表达能增加RhoA及抑制RAC1B活性,对RAC1活性无影响。结论1.ARHGAP11A在肝癌中高表达,与患者临床预后相关;ARHGAP11A在体内外能调控肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力及EMT进程;在肝癌中ARHGAP11A发挥促癌作用。2.在肝癌中,ARHGAP11A的GAP结构作用于RhoA而不作用于Rac1/Rac1B。3.ARHGAP11A促进肝癌恶性进展依赖于RAC1B而不是依赖于RhoA。