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目的1.应用高压水尾静脉注射HBV复制小鼠模型,系统比对分析急、慢性HBV感染模型中特异性免疫应答特点差异。2.应用土拨鼠WHV感染模型,研究土拨鼠T细胞抑制性受体分子Tim-3及其配体Gal-9(Galectin-9)分子特点及其在WHV不同感染状态下分子表达特点。方法1.应用高压水注射pSM2、pAAV/HBV1.2质粒分别建立急性自限性HBV清除小鼠模型(Acute-resolving mouse,ARM)和慢性HBV肝内复制小鼠模型(Persistent replication mouse,PRM);ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)检测ARM和PRM血清中病毒标志物HBsAg、HBeAg表达水平;FACS(Fluorescence-activated cell sorting)检测质粒注射后不同时间点 ARM 和 PRM外周和肝脏中:①主要特异性免疫应答细胞频率的动态变化及差异;②CD8+T、CD4+T细胞表面活化及抑制性受体分子表达的动态变化及差异;③APC细胞(Antigen presenting cell)表型动态变化特点及差异;④肝内HBV特异性T细胞内因子IFN-γTNF-a和IL-2的分泌。2.应用土拨鼠模型,克隆Tim-3和Gal-9分子并分析其分子特点,应用RT-qPCR(Reverse Transcription Real Time Quantitative Polymerase China Reaction)检测其组织表达,以及Gal-9分子在WHV不同感染状态下的表达情况;制备土拨鼠Tim-3分子多克隆抗体,并应用WB(Western blot)和FACS(Fluorescence activated cell sorting)鉴定其功能。结果1.急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫细胞频率动态变化及比对分析:①CD8+T 细胞:HBV 质粒注射后第 4 天(4dpi,4 days post injection)在 ARM 和 PRM中均增多,7dpi在ARM外周血中增多,21dpi在ARM肝脏中增多,而PRM中则没有此现象;②HBV特异性CD8+ T细胞:4-7dpi在ARM中增多,21dpi在ARM肝脏中增多,而PRM中则没有此现象;③DC细胞(Dendritic cells):4dpi在ARM脾脏中增多,7dpi在ARM外周血中增多,14dpi在ARM肝脏中增多,而PRM中则没有此现象;④CD4+T细胞:4dpi在ARM和PRM脾脏中增多;⑤B细胞:21dpi在ARM外周血中特异性增多;⑥MC细胞(Myeloid cells):21dpi在PRM肝内特异性增高;2.急、慢性HBV复制小鼠中CD4+和CD8+ T细胞活化表型的动态变化及比对分析:①CD8+ T细胞活化表型:ARM小鼠脾脏、外周血及肝脏中CD8+ T细胞活化表型CD44表达较PRM增高,抑制性表型CD62L表达较PRM降低;②CD4+T细胞活化表型:ARM脾脏、外周血及肝脏中CD4+T细胞活化表型CD44表达较PRM增高,抑制性表型CD62L表达较PRM降低。3.CD8+T细胞功能检测:HI后21dpi ARM肝内HBV抗原特异性CD8+T细胞分泌细胞因子的能力较PRM增强。4.急、慢性HBV复制小鼠中APC细胞(Antigen presenting cells)表面分子PD-L1(Programmed death ligand 1)、MHCI(Major Histocompatibility Complex Ⅰ)动态变化及比对分析:①DC细胞MHCI表达:21dpi在ARM肝脏中增多;②MC细胞MHCI表达:14dpi在ARM脾脏中增多;14dpi在PRM肝脏中增多,21dpi在ARM小鼠肝脏中增多;③PD-L1:DC细胞PD-L1表达:7dpi在PRM脾脏中增多;21dpi在PRM肝脏中增多;④MC细胞PD-L1表达:21dpi在PRM脾脏中增多;21dpi在ARM肝脏中增多;5.获得土拨鼠Tim-3分子576bp胞外段序列,Gal-9分子全长CDS区序列,相似性比对分析发现土拨鼠Tim-3、Gal-9分子与地松鼠相似性最高,其氨基酸水平相似性分比为97%和98%;6.Tim-3分子mRNA在土拨鼠各器官组织中表达由高到底依次为大肠、脾、肺、心脏、小肠、脂肪、睾丸,而肌肉、肾脏与肝脏中未检测到;Gal-9分子mRNA在土拨鼠各器官组织中高到底依次为睾丸、肾、肝脏、大肠、心脏、肌肉、脾脏、小肠、脂肪、肾脏;7.Gal-9分子mRNA在WHV慢性感染土拨鼠肝脏组织中表达升高,而在急性感染土拨鼠肝组织中表达降低;8.制备兔抗土拨鼠Tim-3多克隆抗体,1:500效价用来WB(Western Blot)检测土拨鼠Tim-3分子的表达;1:50效价可用来流式检测土拨鼠PBMC细胞(Peripheral blood mononuclear cells)中 Tim-3 分子的表达。结论1.急、慢性HBV复制小鼠中特异性免疫的主要免疫细胞频率存在差异:①ARM和PRM早期脾脏中均存在CD8+ T细胞的致敏增殖,但PRM外周致敏的T细胞不能被募集至肝脏发挥抗病毒效应;②HBV抗原特异性CD8+T细胞仅在ARM肝脏中增殖,而PRM肝脏中无病毒特异性T细胞聚集;③ARM中DC细胞早期在脾脏中增殖,随之在外周血中升高,后期肝脏内升高的现象,而PRM中无此现象,提示PRM中DC细胞增殖能力差。2.急、慢性HBV复制小鼠中T细胞活化表型及功能存在差异:①ARM脾脏、外周血和肝脏中T细胞表面受体分子表达与PRM相比,活化性受体表达升高,抑制性受体表达降低,提示PRM中T细胞活化障碍;②ARM肝内HBV特异性CD8+ T细胞杀伤功能较PRM明显增强。3.急、慢性HBV复制小鼠中APC细胞表面分子表达存在差异:PRM肝内DC细胞感染后期表达PD-L1升高,提示PRM中可能存在DC细胞功能耗竭;4.获得土拨鼠Tim-3部分胞外段以及Gal-9全长编码序列。5.Tim-3分子在土拨鼠大肠组织中表达最高,睾丸组织中最低;Gal-9分子在各组织器官中表达广泛,其在睾丸组织中表达最高,在肾脏组织中最低;6.土拨鼠不同WHV感染状态下Gal-9的表达情况存在差异。7.成功制备了 Tim-3胞外段多兔抗土拨鼠多克隆抗体,该抗体有较高的效价和特异性,能够用于WB和FACS的检测。本研究的创新点和意义1.首次利用小鼠HBV复制模型,系统比对分析了 HBV急、慢性复制过程中,外周及肝内特异性免疫免疫应答特征的差异,包括特异性免疫细胞的频率、T细胞及APC细胞活化/抑制表型、T细胞功能的动态变化;2.研究首次发现在HBV慢性复制小鼠中,也存在早期外周免疫器官(脾脏)中CD8+T细胞的致敏增殖,但增殖的细胞不能同ARM中一样,能够被有效募集至肝脏发挥抗病毒作用,为CD8+ T细胞在清除HBV感染中作用的研究提供新的线索。3.本研究首次克隆土拨鼠Tim-3和Gal-9分子序列,同时检测了 Tim-3和Gal-9分子在土拨鼠不同组织中表达情况以及不同WHV感染状态下Gal-9分子的表达情况并进行分析。4.首次制备抗土拨鼠Tim-3多克隆抗体,可以用来检测Tim-3蛋白在的表达。