背景:急性肝功能衰竭病情凶险，死亡率高可达80％以上，其最主要的病理机制即是短时间内肝细胞的大量死亡、丢失，引起的急性肝功能失代偿。急性肝功能衰竭常见病因有病毒、药物、中毒、酒精、肝肿瘤、自身免疫性肝炎、代谢性疾病等。肝移植被认为是治疗急性肝功能衰竭首选的治疗方法，但由于肝移植对技术条件、适应证及组织相容性等要求较高，且部分并发症处理相当棘手，加之肝供体的严重短缺，且肝移植后需终生服用免疫抑制药，使肝移植的临床应用严重受限。　　 骨髓间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种，具有自我更新、多向分化潜能和较强的增殖能力，实验证明MSCs可以分化为神经细胞、心肌细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、肝细胞等，是细胞治疗和组织工程的理想种子细胞。由于MSCs获取、分离、扩增容易、免疫原性低、无道德伦理问题限制等优点，在器官组织损伤后修复、退行性疾病、代谢性疾病等的治疗中有广阔的运用前景。　　 以干细胞为基础的细胞移植、基因治疗和组织工程技术的出现和进展为急性肝衰的治疗提供了新的思路。研究表明骨髓间充质干细胞在体外诱导或体内移植后可分化为具有正常肝细胞表型和功能的肝细胞样细胞。在正常情况下，MSCs处于静息状态，一般不直接参与肝细胞的替代过程。而当肝脏脏受到损伤时，骨髓间充质干细胞可自发或采用人工动员方式从骨髓迁移到肝脏，参与肝的修复，这已在动物实验中得到证实。目前，临床初步研究结果亦表明自体骨髓干细胞肝内移植后可改善重型肝炎和肝硬化患者的肝功能。而干细胞进入体内后的细胞生物学特性，比如：如何归巢(定植)、能否存活、如何迁移、生长分化情况、最后的转归等等问题都未完全明了。因此，对干细胞移植后进行活体动态示踪，对掌握干细胞发挥作用的机制意义重大。　　 用影像学方法客观、准确地反映移植MSCs的存活、增殖、迁移、分化和转归，有助于掌握移植细胞的生物学特性，评价其疗效、安全性和改进治疗方案。鉴于干细胞研究的快速发展和应用等原因，对干细胞移植后进行有效的活体影像示踪具有相当的必要时和紧迫性。以超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)等为主的新型磁共振对比剂(MR)的出现，使MR成像可达至细胞分子水平，成为分子影像检查的重要手段之一。MR成像空间分辨率高，能获取即使是深在体内的组织器官的解剖与生理病理学信息，且无放射性，可无创性地反复动态观察移植细胞在活体内的数量、分布和迁移等，能弥补传统离体组织病理学分析方法的缺陷，是目前临床活体干细胞成像示踪的唯一现实方法。　　 肝组织工程学是将肝脏细胞生物学与工程材料学的原理结合而产生的一门新兴学科，其核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即构造具有生命力的活体组织，用以补充或替代病损的肝细胞、改善或恢复肝组织功能，并力求从解剖和形态结构上对肝脏进行重建，以达到永久性替代的目的。由于基于SPIO的MR成像，其信号强度依赖于SPIO的浓度，因此，本研究先用SPIO和增强型绿色荧光蛋白标记大鼠MSCs，同时于体外构建大鼠MSCs-半乳糖化壳聚糖/海藻酸盐支架复合体，并将之移植至肝内的肝组织工程学方法，不但能增加局部肝组织MSCs的数量和密度，解决常规血管途径移植MSCs后MR信号衰减、消失较快而不能真实反映肝内移植细胞存活状态的不足，也能同时观察MSCs移植后对急性肝衰的治疗效果，同时结合组织病理分析的方法，对了解真实肝脏内环境下同种异体MSCs的存活、分化、转归及治疗机制，探索原位构造肝组织工程及用MR对之进行活体示踪的可行性有重要意义。　　 目的:以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)标记后的骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞，以半乳糖化壳聚糖/海藻酸盐支架材料为载体，探讨用组织工程的原理和方法实现肝内原位构建肝组织的可能行及MR活体示踪肝内细胞-支架移植物的可行性。　　 方法:用梯度离心加贴壁培养法分离、扩增大鼠MSCs，用流式细胞术检测MSCs表型。用慢病毒包装系统中四种质粒系统感染293细胞后收集病毒颗粒并转染大鼠骨髓间质干细胞，检测EGFP-MSCs蛋白表达情况。用与多聚赖氨酸(PLL)结合后终浓度为25μmgFe/mL的SPIO对EGFP-MSCs进行标记。倒置相差显微镜动态观察MSCs的形态学和生长增殖情况，用台盼蓝染色检测细胞的活力，CCK-8法检测双标记细胞增殖能力，Hoechst33258染色法检测细胞凋亡，普鲁士蓝铁染色透射电镜检测细胞对铁的胞吞作用，原子吸收分光光度法测定细胞铁含量。用成骨和成脂诱导分化实验检测标记后MSCs的多向分化能力。将磁标记干细胞悬用1％琼脂糖制备不同浓度细胞悬液，放入自制模具中用1.5T磁共振仪行体外细胞MR成像检查。EGFP-MSCs体外扩增并用SPIO-PLL标记后接种到半乳糖化壳聚糖/海藻酸盐支架上，通过倒置荧光相差显微镜、扫描电镜观察干细胞在支架上的形态学特征、粘附和生长增殖情况，用CCK-8法检测支架对于细胞的生物相容性和支架上细胞的生长增殖能力，同时探讨支架负载细胞的最佳数量及较理想的细胞接种方法，并用组织病理学(HE)染色法加以证实。用CCl4腹腔注射建立大鼠急性肝损伤模型(18只)，分为A、B两组，建模后48小时将构建好的干细胞-支架复合体(A组)或裸支架(B组)用外科手术的方法植入大鼠肝内，术后3天、7天、14天各处死大鼠1只，余下大鼠于28天时全部处死。大鼠处死后用收割肝脏、取材、石腊包埋，分别制作冰冻切片和石腊包埋切片，行HE染色、普鲁士蓝染色和免疫组化染色(EGFP、AFP、ALB)，观察支架上种子细胞的存活、分化情况及诱导的免疫反应及其程度。支架移植后定期抽血复查肝功能(ALT)。用1.5T的MR成像仪于移植前、移植后1小时、3天、7天、14天和28天行大鼠活体肝脏扫描，对肝内移植物进行示踪和组织病理对照分析。　　 结果:用梯度离心加贴壁培养法深可获取较高纯度的高表达MSCs表型(CD29、CD44)和低表达造血细胞标记(CD45、CD11b)的干细胞。慢病毒载体介导MSCs转染EGFP基因效率高，细胞在荧光显微镜下发明亮绿色荧光，流式细胞术检测示阳性细胞比率达94％以上，且能长期稳定表达。用25μg Fe/ml的SPIO标记EGFP-MSCs的阳性率达100％，标记后的MSCs生长排列、形态与未标记组相比无明显改变，SPIO标记不降低MSCs的细胞活力，不增加细胞凋亡率，不影响细胞的增殖能力、成骨分化和成脂分化能力。体外实验证明当SPIO标记细胞数量为5×103以上时可为1.5T的MR检出，MR信号衰减程度与细胞浓度高度相关，三个扫描序列中以T2*WI序列最为敏感，T2WI序列次之，TIWI序列居末。半乳糖化壳聚糖/海藻酸盐支架具有良好的生物相容性，无明显细胞毒性，干细胞能够支架上较好地粘附、生长和增殖，并爬行生长至支架内部，以负载数量和细胞死亡脱落之间做权衡，单个支架种植细胞以1～2×106为佳；离心法种植细胞，细胞的分布较佳，细胞丢失较少。腹腔注射CC14和橄榄油混合液(体积比为1：1，用量0.3ml/100g)可以成功制造典型大鼠急性肝功能衰竭的动物模型。支架大鼠肝内移植具有可行性和安全性。干细胞-支架复合体移植后可相对促进急性肝损伤大鼠肝功能的恢复。MR扫描肝内磁标记干细胞-支架移植物显示T2*WI序列的SNR值，移植后1h，3d，7d，14d，28d的SNR值为3.14±0.13、3.28±0.41、3.53±0.29、3.89±0.38和5.45±1.64，与移植前的肝脏信号值(19.04±2.44)相比差异极其显著；而裸支架植入区信号在观察期内均无明显变化，示MR扫描可对干细胞-支架复合体肝内移植后进行有效示踪。用组织病理学方法(用冰冻切片、免疫组化、HE染色、普鲁氏蓝染色等)证实粘附于支架上的同种异体干细胞可在大鼠肝内长期存活，并能在大鼠肝脏内环境下实现向肝细胞方向的分化，部分细胞可向肝内迁移。支架肝内移植后可诱发较明显的免疫反应。　　 结论:密度梯度离心法加贴壁培养法可获取较高纯度的MSCs。慢病毒介导EGFP基因转染MSCs效率高，EGFP可长期稳定高表达，慢病毒载体是干细胞基因转染的强有力工具。25ugFe/ml浓度SPIO-PLL标记MSCs，不影响MSCs的生物学特性，方法简便、有效，可满足MSCs磁共振示踪的要求。磁标记细胞体外磁共振成像示MR信号衰减程度与细胞浓度呈明显相关，各扫描序列中以T2*WI序列最为敏感。体外实验示半乳糖化壳聚糖/海藻酸盐支架对干细胞有良好的生物相容性。干细胞-支架复合体肝内移植原位构造肝组织具有可能性。MR可对肝内磁标记标记干细胞-支架移植物进行有效示踪。