三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）属于乳腺癌的一种特殊亚型,具有转移早、侵袭性高、复发率高、预后差、致死率高等特点。临床针对TNBC的传统治疗手段（手术、放疗、化疗）存在着治疗效果有限、毒副作用大等缺点。光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）是一种利用可见光光源激活光敏剂产生细胞毒性活性氧（Reactive oxygen species,ROS）以精准杀灭癌细胞的非侵入性肿瘤治疗新手段。PDT产生的ROS在诱导癌细胞凋亡的同时,还可引发免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death,ICD）,有效激活全身性抗肿瘤免疫反应。然而传统的PDT受到可见光的组织穿透性差、光敏剂缺乏肿瘤组织靶向性、肿瘤微环境的免疫抑制等缺陷的限制,对深层肿瘤的治疗效果不佳,临床应用范围有限。上转换纳米粒（Upconversion nanoparticles,UCNPs）作为一种新型无机纳米材料,可在近红外光（Near-infrared light,NIR）激发下发射能量更高的可见光,以克服传统光源的组织穿透能力差的缺陷;UCNPs也可作为载体材料实现药物的靶向递送,从而解决光敏剂靶向性差、生物利用度低的问题。然而由于肿瘤的多药耐药性与免疫抑制微环境,临床实践中单一的治疗手段无法完全抑制TNBC的发展进程。近年来,化疗与PDT的联合疗法在肿瘤临床前与临床研究中备受关注。一方面,化疗可提高肿瘤对PDT的敏感性,实现化疗协同PDT的抗肿瘤治疗效果;另一方面,某些化疗药物与PDT产生的ROS均可诱导肿瘤发生ICD,增强其免疫原性,促进免疫系统对肿瘤的识别和清除。因此,利用上转换纳米材料与刺激响应性药物靶向递送技术,可实现药物向肿瘤的靶向递送与可控释放,有望达到深层PDT联合化疗的协同抗肿瘤作用,并增强ICD诱导的抗肿瘤免疫治疗效果。本研究采用高温溶剂热法合成了形态完整、尺度均一,平均粒径为42.13±1.42nm的UCNPs。UCNPs可在980 nm NIR激发下发射540 nm的可见光,与光敏剂玫瑰红素（Rose bengal,RB）的最大吸收峰重合,从而高效激活RB产生ROS。同时,本研究以唾液酸（Sialic acid,SA）作为肿瘤靶向配体,以酮缩硫醇（Thioketal,TK）作为ROS响应性嵌段,通过酯化与酰胺反应合成ROS响应性嫁接物唾液酸-聚乙二醇-酮缩硫醇-聚乳酸羟基乙酸（SA-PEG-TK-PLGA,SPTP）;SPTP可在水中自组装形成胶束,临界胶束浓度为79.43μg/m L,粒径为54.30±2.98 nm。以化疗药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）与光敏剂RB为模型药物,分别通过乳化溶剂挥发法包载RB、透析法包载DOX,制得ROS响应性唾液酸修饰的上转换纳米给药系统SPTP@UCNP-RB-DOX,实现对RB与DOX的有效负载,载药量分别为4.87±0.24%和4.36±0.04%,粒径为64.58±2.18 nm。SPTP@UCNP-RB-DOX在NIR照射下可激活RB产生ROS,过量的ROS引发SPTP解聚,使其负载的DOX呈现快速释放特征,14 h时DOX的累计释放率达到75%以上。以小鼠乳腺癌细胞4T1为模型细胞,考察受体介导的细胞内吞作用,结果表明SPTP@UCNP-RB-DOX更易被4T1细胞摄取,这主要是由于纳米粒表面修饰的SA可与肿瘤细胞表面过表达的E-选择素受体特异性结合。经由细胞摄取的SPTP@UCNP-RB-DOX可在NIR照射下提高细胞内ROS水平,继而响应性释放DOX并发生溶酶体逃逸,从而有效杀伤肿瘤细胞。4T1细胞接受SPTP@UCNP-RB-DOX（50μg/m L）辅以NIR（0.5 W/cm~2,10 min）处理,共孵育24 h后可造成约52.9%的细胞死亡。同时,释放的DOX与ROS均可诱导肿瘤细胞发生ICD,提高损伤相关分子模式（Damage associated molecular patterns,DAMPs）的暴露水平。此外,SPTP@UCNP-RB-DOX在三维多细胞肿瘤球模型中展现出良好的渗透能力,并在NIR处理后显著促进肿瘤细胞凋亡,具有较强的生长抑制作用。通过在小鼠的乳垫注射4T1细胞的方式构建原位TNBC小鼠模型,考察纳米粒的体内分布行为,结果表明SPTP@UCNP-RB-DOX在尾静脉注射后可逃避网状内皮系统的吞噬与截留,快速富集于肿瘤组织,具有良好的肿瘤靶向能力。荷瘤小鼠接受SPTP@UCNP-RB-DOX辅以NIR治疗后,原位肿瘤的生长受到显著抑制,肿瘤组织中出现大面积的坏死与凋亡区域,小鼠肺组织中肿瘤转移灶明显减少,且肺中细胞增殖标志物Ki67的表达显著下调,荷瘤小鼠生存期大幅延长,说明该治疗策略具有良好的体内抗肿瘤效果并能够有效抑制TNBC的自发性肺转移。同时,SPTP@UCNP-RB-DOX辅以NIR治疗策略可以有效引起肿瘤发生ICD,提高DAMPs的暴露水平,促进CD8+T细胞的活化增殖与在肿瘤部位的浸润,并激活全身性抗肿瘤免疫应答。在治疗与观察期间,小鼠的体重保持稳定,肝、肾功能正常,未发现明显的心脏毒副作用,说明SPTP@UCNP-RB-DOX的体内安全性良好。肿瘤的复发与转移是造成TNBC死亡率居高不下的主要原因。尽管在上述第一部分研究中构建的ROS响应性唾液酸修饰的上转换纳米给药系统,可实现NIR照射下的PDT联合化疗与肿瘤ICD诱导的全身性抗肿瘤免疫反应,但近期研究表明,PDT与化疗药物引起的抗肿瘤免疫反应的疗效有限,不足以消除肿瘤残留组织和抑制转移,这是由于肿瘤ICD常受到肿瘤微环境的免疫抑制作用。ICD过程中,三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）被大量释放,用于招募树突状细胞（Dendritic cells,DCs）并促进其成熟,然而在肿瘤微环境中,ATP会在胞外核苷酸酶CD73的催化下迅速降解为腺苷（Adenosine,ADO）,ADO会激活免疫细胞的抑制通路,加剧免疫抑制的微环境。因此,当具有ICD诱导能力的PDT、化疗与anti-CD73抗体联合应用时,可阻断ADO诱导的免疫抑制作用,增强ICD引起的特异性抗肿瘤免疫反应。近年来,受自然界生物系统的启发,利用细胞膜对纳米粒进行功能化修饰使纳米粒具备良好的仿生性能,在药物递送领域引起了广泛的关注。其中,癌细胞膜特有的功能膜蛋白使其具备独特的免疫逃避与同源肿瘤靶向能力,因此癌细胞膜功能化的纳米粒可在体内实现长循环与肿瘤靶向递送。由于第一部分研究中SPTP@UCNP-RB-DOX的物理载药方式易在体内转运过程中泄露药物,第二部分研究采用共价键合的载药策略,首先通过化学键合反应合成ROS响应性前药聚乙二醇-酮缩硫醇-阿霉素（PEG-TK-DOX,PTD）。随后,分别采用酰胺反应与加成反应,将光敏剂RB与ROS响应性前药PTD直接嫁接至UCNPs的表面,制备ROS响应性共键合RB与DOX的上转换纳米粒UCNP-RB/PTD,粒径为48.85±4.30nm,RB与DOX的载药量分别为2.03±0.21%与2.43±0.14%。在NIR（0.5 W/cm~2）照射10 min后,UCNP-RB/PTD呈现ROS响应性药物释放行为,12 h时DOX的累计释放率达到60%以上。进一步采用超声法制得癌细胞膜功能化的ROS响应性上转换纳米递药系统CM@UCNP-RB/PTD,并采用免疫印迹法与免疫胶体金标记技术证明其表面成功保留功能膜蛋白:CD47、N-cadherin和Ep CAM。以小鼠乳腺癌细胞4T1与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为模型细胞,对纳米粒的细胞摄取行为进行考察,结果表明CM@UCNP-RB/PTD在4T1细胞中的内吞作用显著增强,说明其能够被同源肿瘤细胞特异性摄取;同时,RAW264.7细胞对CM@UCNP-RB/PTD的摄取量显著降低,说明该纳米粒能够有效逃避巨噬细胞的吞噬。进一步以小鼠乳腺癌细胞4T1为模型细胞,对细胞内ROS水平、药物释放行为及细胞毒性进行考察。结果显示,NIR照射下的CM@UCNP-RB/PTD（50μg/m L）在细胞水平能够产生大量ROS并引起DOX的响应性释放行为;释放的DOX可快速逃逸溶酶体,并进入细胞核发挥疗效,共孵育24 h后造成约57.6%的细胞死亡。更重要的是,CM@UCNP-RB/PTD辅以NIR可显著性提高DAMPs暴露水平,诱导肿瘤发生ICD,并在体外共孵育体系中有效刺激DCs的成熟,有利于促进免疫系统对肿瘤的识别与杀伤。通过在小鼠的乳垫注射4T1细胞的方式构建原位TNBC小鼠模型,评价CM@UCNP-RB/PTD的体内分布、体内抗肿瘤疗效与免疫激活情况。结果表明,CM@UCNP-RB/PTD经尾静脉注射后2 h时即呈现肿瘤部位聚集性分布现象,并随着给药时间的延长,肿瘤内纳米粒的蓄积量不断增加。与其他给药组相比,CM@UCNP-RB/PTD联合anti-CD73抗体辅以NIR治疗可以最大程度抑制原位肿瘤生长,抑瘤率达到约93.4%,并有效抑制自发性肺转移,延长小鼠生存期;同时该给药策略可显著提高DAMPs的暴露水平,提高成熟DCs在淋巴结中的比例,由生理盐水组的约7.1%增至约30.3%,进一步促进细胞毒性T细胞与效应记忆T细胞的增殖与在肿瘤部位的浸润,显著抑制调节性T细胞的分化,提高肿瘤、脾脏、外周血中抗肿瘤细胞因子的含量,说明肿瘤微环境的免疫抑制得到缓解,特异性T细胞免疫应答得到大幅增强。进一步通过构建小鼠4T1乳腺癌双侧肿瘤模型与肺转移模型,考察不同给药方案激活的免疫监视功能对远端肿瘤与肺转移的抑制效果。结果表明,CM@UCNP-RB/PTD联合anti-CD73抗体辅以NIR治疗显著抑制远端肿瘤中CD73的表达,且对远端肿瘤的生长抑制作用较强,其生长抑制率达到约89.7%,同时在给药后15天内有效减少肺转移灶数量。此外,CM@UCNP-RB/PTD的体内安全性良好,未造成体内细胞或组织损伤。综上所述,本研究针对TNBC进展快、侵袭性高且缺乏有效的临床靶向治疗手段的问题,构建了两种ROS响应性上转换纳米给药系统,均能实现肿瘤的靶向递送与药物的响应性释放,在NIR照射下均可对实体瘤产生化疗联合光动力治疗效果;同时引发肿瘤ICD以提高其免疫原性,并缓解肿瘤微环境的免疫抑制,有效激活全身性抗肿瘤免疫应答,以抑制肿瘤的转移与复发,最终实现安全、高效的光动力治疗、化疗与免疫治疗的联合抗肿瘤作用,为临床TNBC治疗提供新的方法与思路。