食管癌作为威胁中国人民健康的重大疾病,是常见的恶性肿瘤中的第四位,食管鳞形细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最主要的死亡原因之一,生存率很低的一个主要原因是肿瘤患者在初次诊断为食管癌时就已经发生了肿瘤的转移,其预后极差主要与患者发生的广泛转移有关。故此,肿瘤转移已成为影响患者5年存活期的重要因素,其中食管床的局部淋巴结转移(Regional lymph node metastasis)在临床上非常重要,理应受到密切关注。在大量有关食管鳞癌的研究中,尚未有食管鳞癌组织与转移淋巴结中的鳞癌细胞的蛋白组学研究的报道,究其原因,可能与在转移淋巴结中除了转移的食管鳞癌细胞外,还存在大量的淋巴细胞、间质细胞等,如何排除非癌细胞的干扰,以保证样本的均质性存在相当的困难。为了探讨鳞癌细胞在食管鳞癌组织与转移淋巴结中的蛋白质表达差异,本研究首次应用激光捕获显微切割( Laser capture microdissection,LCM)技术分离出正常食管上皮细胞、食管鳞癌组织和转移淋巴结中的食管鳞癌细胞,使用差异蛋白质组技术包括双向凝胶电泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱( Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-time of flight, MALDI-TOF)技术对这些细胞的蛋白进行分析,获得了一些可能与食管鳞癌恶变、转移过程有关的标志蛋白质,推测其差异蛋白质的功能,并从蛋白质的整体水平上探讨这些差异候选蛋白质是否与食管鳞癌可能的发生或转移机制相关,并为开展临床早期诊断、寻找治疗靶点等方面提供有价值的理论依据。第一部分激光捕获显微切割技术在食管鳞癌蛋白质组学研究中的应用目的:探讨激光捕获显微切割技术在获得较单一食管鳞癌细胞中的价值,为食管鳞癌蛋白质组学的研究奠定基础。方法:通过激光捕获显微切割技术分别获取食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞、食管鳞癌组织和转移淋巴结中的鳞癌细胞。结果:激光捕获了较纯的正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞、食管鳞癌组织和转移淋巴结中的鳞癌细胞,分别获得到了分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱。结论:本研究结果提示激光捕获显微切割可以有效地解决组织异质性的问题,能较好地获取较为均一的目的细胞。第二部分正常食管上皮细胞和食管鳞癌组织中的鳞癌细胞的差异蛋白组学分析目的:分析食管鳞癌和正常食管上皮细胞蛋白质的表达差异,获取两者的蛋白表达差异。方法:通过激光捕获显微切割技术分离食管鳞癌和正常食管上皮细胞的纯细胞,通过双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白。结果:分别发现了38-55个差异蛋白点,通过质谱鉴定出20种有意义的蛋白,其中11种蛋白如galectin 7、14-3-3 proteinε等在食管鳞癌细胞表达明显增高,9种蛋白如MTCBP-1等表达下调。结论:食管鳞癌和正常食管上皮细胞的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示食管鳞癌的发生是多种蛋白质功能共同作用的结果。第三部分食管鳞癌组织和转移淋巴结中的鳞癌细胞的差异蛋白质组学分析目的:分析食管鳞癌组织和转移淋巴结中的鳞癌细胞的蛋白质表达差异。方法:通过激光捕获显微切割技术分离食管鳞癌组织和转移淋巴结中的鳞癌细胞,通过双向电泳和质谱的方法检测两者表达的差异蛋白。结果:分别发现了20-29个差异蛋白点,通过质谱鉴定出6种有意义的蛋白,转移淋巴结中的鳞癌细胞中如等5种蛋白如peroxiredoxin 1,gelsolin family-capping proteins等表达明显增高,1种蛋白MTCBP-1表达下调。结论:食管鳞癌组织中的鳞癌细胞与转移淋巴结中的鳞癌细胞的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,提示这些蛋白质可能与食管鳞癌的淋巴结转移有关。第四部分差异候选蛋白的验证目的:为了保证鉴定结果的可靠性,以及便于将来这些蛋白作为临床早期诊断的标志或作为治疗的药物时更易检测,验证差异蛋白确实在正常食管上皮组织、食管鳞癌组织和转移淋巴结间存在显著差异。方法:使用westren blotting和免疫组化技术对差异候选蛋白进行差异分析、验证。结果:MnSOD、14-3-3 proteinε在食管鳞癌组织中的鳞癌细胞的表达高于正常食管上皮细胞的表达,Gelsolin family-capping proteins在转移淋巴结中的鳞癌细胞的表达高于食管鳞癌组织中的鳞癌细胞的表达。结论:免疫组化分析和western blotting技术对差异候选蛋白的验证结果与蛋白质组技术的分析鉴定结果完全一致。