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第一部分类风湿关节炎外周血破骨细胞活性的研究目的:研究类风湿关节炎(RA)患者外周血破骨细胞前体细胞(OCP)分化能力及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。方法:取7例RA患者和9名健康对照的外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs),采用RANKL和M-CSF体外诱导培养破骨细胞(OC)。对培养14天后的细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,计数TRAP染色阳性、胞核≥3个的细胞(定义为OC)。骨吸收实验考察OC的功能。运用ELISA方法检测15例RA患者和9名健康对照血清TNF-α水平。对RA患者OC数量和TNF-α水平与疾病活动性指标包括红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)进行相关分析。结果:(1)RA患者外周血生成OC数量显著高于健康对照,分别为27.8±10.8个/10个视野(±SD)和14.4±6.1个/10个视野(P<0.05);(2)RA患者TNF-α水平显著高于健康对组,分别为18.8±5.2 pg/ml和9.5±3.0 pg/ml(P<0.05);(3)RA患者OC数量与ESR正相关(r=0.912,p=0.000),与CRP无显著相关性;(4)RA患者外周血TNF-α水平与ESR显著正相关(r=0.936,p=0.000),与CRP无显著相关性;(5)RA患者外周血TNF-α水平与OC数量显著正相关(r=0.913,p=0.000)。结论:RA患者外周血OCP数量显著增高,血清TNF-α水平显著增高,二者可能是造成炎症局部OC活性增高进而引起关节骨质破坏的机制。第二部分甲氨蝶呤对类风湿关节炎外周血破骨细胞活性的影响目的:研究甲氨喋呤(MTX)对类风湿关节炎(RA)外周血破骨细胞前体细胞(OCP)分化能力及外周血单个核细胞(PBMCs)分泌TNF-α的影响。方法:采集3例健康志愿者者PBMCs,在含不同浓度(0 nM、1 nM、10 nM、102 nM、103 nM和104 nM)的MTX的培养液中培养24、48、72小时,采用CCK8方法检测细胞活力。采用RANKL和M-CSF诱导PBMCs使其向OC分化,在培养液中加不同浓度(1 nM、10 nM和102 nM)MTX,14天后对细胞进行TRAP染色,计数TRAP染色阳性、胞核≥3个的细胞(定义为OC)。收集48小时的培养上清液,运用ELISA方法检测其TNF-α水平。结果:(1)用CCK8检测显示较低浓度(1 nM、10 nM和102 nM)MTX对细胞活力影响不大,与对照组(0 nM)无显著差别。较高浓度MTX(103 nM和104 nM)使细胞活力显著降低;(2)10 nM和102 nM的MTX加入OC培养体系,产生OC的数量显著低于对照组,分别为26.3±7.6(±SD)、13.6±6.0和35.8±6.6个/10个视野(P<0.05);(3)10 nM和102 nM的MTX加入OC培养体系,培养上清液中的TNF-α水平也较对照组(0 nM)显著降低,分别为45.3±4.7、39.9±3.0和101.3±1.5 pg/ml(P<0.05)。结论:MTX抑制PBMCs向OC分化,也抑制PBMCs分泌TNF-α,可能是其治疗RA的重要作用机制。