目的：1，从健康人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞（umbilical cordmesenchymal stem cells,UC-MSCs），并对UC-MSCs的生物学特性进行鉴定；2，应用慢病毒介导的RNA干扰技术，构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体，并进行慢病毒颗粒的包装，纯化，浓缩及滴度测定；为下一步感染UC-MSCs奠定基础，实现有效沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达。3，使用Fas基因的siRNA慢病毒表达载体，建立Fas基因稳定干扰的人UC-MSCs细胞株，检测其基因及蛋白表达的情况，为下一步使用低表达Fas基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础，为再生障碍性贫血的治疗寻找新的途径。方法：1，采用组织块贴壁法分离培养UC-MSCs，培养两周左右获得贴壁细胞，细胞长至80%融合时，胰蛋白酶消化传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测其细胞表面标志；检测体外诱导成骨和成脂分化的能力；2，根据Fas基因mRNA序列，设计四组靶向Fas的shRNA序列，合成，退火形成双链DNA片段，与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞转化，对长出来的阳性克隆进行测序和对比分析，并对阳性克隆进行PCR鉴定，通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。3，以不同的感染复数（multiple of infection，MOI，分别为0、10、30、50、80、100）的重组慢病毒载体感染UC-MSCs，通过EGFP的表达筛选最佳MOI；用重组慢病毒载体以最佳MOI值感染UC-MSCs，应用Real time-PCR和Western blot检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果：1，组织贴壁法体外培养10d左右，成纤维样UC-MSCs从组织块中爬出；细胞传代培养至第15代，无明显形态和增殖能力改变；细胞高表达CD44和CD73，而阴性表达CD34。体外诱导实验证明UC-MSCs具有向成脂和成骨分化的能力。2，经酶切和基因测序检测证明Fas-siRNA干扰慢病毒载体构建成功，病毒悬液滴度达到3x108TU/ml。3，通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最佳MOI为30，此时对细胞的感染效率可达到85%以上。Real time-PCR和Western blot的结果显示干扰组细胞的Fas表达水平较对照组显著降低。结论：1、体外分离了UC-MSCs，且具有间充质干细胞生物学特性；2、构建并包装出高滴度的人Fas基因的siRNA慢病毒表达载体；3、筛选出最佳MOI值为30，携带人Fas基因的siRNA慢病毒颗粒感染UC-MSCs后，在基因及蛋白水平Fas表达较对照组显著降低。目的：1、从健康人的脐带组织中分离和培养出脐带间充质干细胞（umbilical cordmesenchymal stem cells,UC-MSCs），并对其生物学特性进行研究；2、从生长良好的P3-P5代UC-MSCs的无血清培养上清液中分离出外体（exosomes），并对其生物学特性进行研究；3、采用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离外周血淋巴细胞，探讨UC-MSCs来源的exosomes对外周血淋巴细胞的免疫影响。方法：1、采用组织块贴壁法分离培养UC-MSCs，培养两周左右获得贴壁细胞，细胞长至80%融合时，胰蛋白酶消化传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态；流式细胞仪检测其细胞表面标志；体外检测其成骨和成脂分化的能力。2、无菌收集生长良好的P3-P5代UC-MSCs的无血清培养上清液，高速离心法获得细胞培养上清液的浓缩液，使用蔗糖密度梯度超速离心分离纯化exosomes；电子显微镜观察exosomes形态；流式细胞仪检测免疫表型CD44、CD73。3、使用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离外周血淋巴细胞，将UC-MSCs来源的exosomes与外周血淋巴细胞共培养，MTT法检测UC-MSCs来源的exosomes对淋巴细胞增殖的影响；ELISA法检测UC-MSCs来源的exosomes对淋巴细胞分泌细胞因子IL-4和INF-γ的影响。结果：1、如第一部分所述，组织贴壁法体外培养10d左右，成纤维样UC-MSCs从组织块中爬出；细胞传代培养至第15代，无明显形态和增殖能力改变；细胞阳性高表达CD44和CD73，而阴性表达CD34。体外诱导实验证明UC-MSCs具有向成脂和成骨分化的能力。2、电子显微镜观察UC-MSCs来源的exosomes为直径30-100nm的呈椭圆或蝶形膜性小囊泡，中间显示低密度电子成分，流式细胞仪检测高表达黏附分子CD44(54.36%)与干细胞标志物CD73(30.56%)。3、通过将UC-MSCs来源的exosomes与外周血淋巴细胞共培养，MTT法和ELISA法检测培养上清液结果表明，不同浓度的exosomes均抑制外周血淋巴细胞增殖且有剂量依赖性，同时抑制细胞因子IL-4和INF-γ的分泌有剂量依赖性。结论：1、体外分离UC-MSCs，鉴定其具有间充质干细胞生物学特性；2、分离出了UC-MSCs来源的exosomes，并对其进行鉴定；3、UC-MSCs来源的exosomes能抑制淋巴细胞的增殖和干扰细胞因子IL-4和INF-γ的分泌，且有剂量依赖性。