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一、研究背景冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)作为心血管疾病的高发病症,其患病率和死亡率仍逐年增高,是全球死亡率最高的疾病之一。据统计,我国心血管病患病人数已超过2.9亿,其中,不稳定性心绞痛(Unstable angina,UA)作为冠心病的典型急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是临床常见疾病,属中医的“胸痹”、“心痛”范畴。《黄帝内经·灵枢篇》记载:“痛连肩背或胸痛彻背、背痛彻心…旦发夕死,夕发旦死…”;汉代东汉·张仲景《金匮要略》云“夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者,责其极虚也。今阳虚知在上焦,所以胸痹、心痛者,以其阴弦故也”,首次明确提出胸痹的发病机制为“阳微阴弦”。本虚标实是冠心病的病机特点,流行病学调查研究显示血瘀、阳虚是冠心病的两种主要证候要素,而不稳定性心绞痛患者的证候要素以实证为主,血瘀证最多,虚证证候要素中阳虚证最多。因此,阳虚血瘀作为冠心病不稳定性心绞痛的基本病机,温阳活血法便成为其主要治法。根据多年临床经验,以温阳活血为治法配伍而成的临床有效验方稳心汤,药物组成如下:党参15 g、姜黄9 g、黄芪15 g、赤芍15 g、川芎10 g、莪术9 g、肉桂3 g、瓜蒌12g、大黄(后下)6g、细辛3g、炙甘草6g。在实际的临床应用中,稳心汤治疗UA阳虚血瘀证患者具有良好疗效,其疗效作用机制尚待研究。小分子核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类长度约18-22个核苷酸的新型内源性、小分子、非编码RNA,通过对目标信使RNA的降解或负调控基因表达,参与心脏发育、生理和病理等过程,研究发现,miRNA可以调节不稳定型心绞痛的发展,其机制涉及心肌细胞凋亡和内皮细胞损伤的调节。同时,已经有大量研究证明了不稳定性心绞痛与心肌细胞凋亡的关系,多种miRNA、信号通路、蛋白、炎症因子参与不稳定性心绞痛的诊断、治疗,并与心肌细胞凋亡过程密切相关。miR-126-5p 作为 miR-126 家族(miR-126-5p,miR-126-3p)成员之一,研究报道其表达水平与冠心病心绞痛病变的严重程度呈负相关,在冠心病心绞痛、多支病变、SYNTAX高评分患者中显著下调,其表达升高具有抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的作用。miR-126-5p可以靶向多种基因类型,调节细胞的凋亡、增殖和分化,与癌细胞和内皮细胞的凋亡密切相关,作用机制可能与调节Bcl-2蛋白表达有关。基于nmiR-126-5p在冠心病心绞痛患者中的表达特点及对细胞凋亡的调控作用,其有望成为调控心肌细胞凋亡的潜在研究靶点。为验证稳心汤的临床疗效及探索其对miRNA的调节作用,本研究围绕冠心病UA患者进行了临床疗效观察,并基于miR-126-5p/Bcl-212/Caspase-9/Caspase-3调控网络对稳心汤的分子机制进行了探索。以期阐释温阳活血方治疗UA的科学内涵,为临床中医治疗冠心病提供具体的、物质的微观辨证论治基础。二、研究目的1、稳心汤治疗UA阳虚血瘀证的临床有效性2、稳心汤对UA阳虚血瘀证患者miR-126-5p表达差异的影响3、稳心汤对H2O2诱导的缺氧心肌细胞凋亡及miR-126-5p/Bcl-212/Caspase-9/3网络基因表达的影响三、研究方法1.稳心汤治疗冠心病不稳定性心绞痛阳虚血瘀证的临床观察研究(1)病例纳入及治疗方法:纳入80例经冠脉造影证实的UA阳虚血瘀证患者,随机分为试验组(n=40)和对照组(n=40),病例来自于中国中医科学院广安门医院及首都医科大学附属北京安贞医院。对照组进行西药常规治疗;试验组在西医治疗的基础上加服稳心汤,1剂/日,分早晚两次服用,连续服用4周。所有受试病例在试验期间不得合并使用其他中药汤剂和中成药制剂;(2)观察指标:生活质量评价:西雅图心绞痛调查量表(Seattle Angina Questionnaire,SAQ);中医证候评分(采用中医阳虚血瘀证候积分量表);安全性指标(肝肾功能检测);血脂检测(高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C),甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA))等。2、稳心汤对冠心病不稳定性心绞痛阳虚血瘀证患者miR-126-5p表达差异的影响(1)临床样本:14例经稳心汤治疗的UA阳虚血瘀证患者,分别抽取治疗前后外周静脉3mL,处理获得总RNA;(2)利用qRT-PCR技术,检测温阳活血方治疗前后的UA患者血液样本miR-126-5p基因及Bcl-212/Caspase-9/Caspase-3调控网络的相关基因表达。3、稳心汤对H2O2诱导的缺氧心肌细胞凋亡及miR-126-5p/Bcl-212/Caspase-9/3网络基因表达的影响(1)细胞培养(H9c2心肌细胞);(2)心肌损伤模型建立,H2O2诱导缺氧心肌细胞模型;(3)稳心汤剂最佳作用时间筛选和最佳作用浓度筛选;(4)细胞实验分组:A、正常组(Control);B、模型组(Model);C、模型+稳心汤组(Model+WenXin);(5)细胞增殖检测:通过CCK-8法检测各组细胞增殖情况;(6)基因定量:即时聚合酶链锁反应(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测(7)蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)检测;(8)流式细胞技术进行细胞周期及细胞凋亡检测;四、研究结果1、稳心汤加西药常规治疗UA的临床有效性及安全性(1)经稳心汤治疗后,两组UA患者的西雅图心绞痛调查量表(SAQ)评分显著提高,同时中医证候积分显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);组间比较试验组优于对照组(P<0.05);(2)稳心汤显著降低UA患者的甘油三酯(TG)水平,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05);(3)两组UA患者的肝肾功能等检测指标在治疗前后无明显变化差异(P>0.05)。2.稳心汤加西药常规治疗能上调UA患者的miR-126-5p表达(1)对14例稳心汤加西药常规治疗前后的UA阳虚血瘀证患者外周静脉血进行qRT-PCR定量检测,结果显示治疗后的miR-126-5p水平较治疗前明显升高(P<0.05)。(2)对Bcl-212/Caspase-9/Caspase-3调控网络的基因定量检测显示,稳心汤治疗后UA患者的Bcl-212基因表达产生上调(P<0.05),且与miR-126-5p的表达呈现正相关趋势;而Caspase-9/Caspase-3基因的表达在稳心汤治疗后呈现表达下降趋势,与Bcl-212及miR-126-5p的表达呈现负相关。3、稳心汤对H2O2诱导的缺氧心肌细胞凋亡及miR-126-5p/Bcl-212/Caspase-9/3网络基因表达的影响(1)稳心汤上调H2O2诱导的缺氧心肌细胞miR-]26-5p表达。建立H2O2诱导的缺氧心肌细胞模型,探索稳心汤对miR-126-5p的表达调节及与心肌细胞凋亡的关系。qRT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组miR-126-5p表达显著下调(P<0.05);而模型+稳心汤组的miR-126-5p表达较模型组显著上调(P<0.05)。(2)稳心汤对心肌细胞Bcl-212/Caspase-9/Caspase-3凋亡通路蛋白具有调节作用。蛋白检测结果显示:与正常组相比,模型组Bcl-212蛋白表达降低(P<0.05);而模型+稳心汤组的Bcl-212蛋白表达较损伤模型组显著上调(P<0.05);与正常组相比,模型组Caspase-9/3蛋白表达升高(P<0.05);而模型+稳心汤组的Caspase-9/3蛋白表达较损伤模型组降低(P<0.05)。(3)稳心汤降低H2O2诱导的缺氧心肌细胞凋亡。流式细胞检测结果显示:与正常组相比,模型组心肌细胞凋亡率显著上调(P<0.05);模型+稳心汤组的细胞凋亡率较损伤模型组显著下调(P<0.05)。以上实验结果提示miR-126-5p的表达调节与心肌细胞凋亡具有密切相关性。五、研究结论1、稳心汤联合常规西药治疗UA阳虚血瘀证具有临床有效性及安全性2、稳心汤可能具有调节UA患者基因表达的作用3、稳心汤具有抗细胞凋亡的作用,其作用机制可能与上调miR-126-5p的表达并靶向调控Bcl-212/Caspase-9/3网络通路有关