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白细胞介素-9（Interleukin-9,IL-9）是γ链共受体细胞因子家族成员,可特异性结合淋巴细胞、肥大细胞等多种细胞表面的白介素-9受体α链（IL-9Rα）,产生促细胞生长、促细胞因子产生等多种免疫调节效应,在过敏性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤免疫中发挥多种多样的功能。尽管IL-9在哺乳动物上有强大的免疫调节作用,但禽类IL-9是否具有相似功能尚不清楚,目前鸡IL-9（chIL-9）仅在基因组中有注解。为此,本研究克隆了 chIL-9基因,分析了其分子进化与组织分布;重组表达了 chIL-9蛋白并测试了其在体外和体内的生物学活性;制备了针对chIL-9蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体,并建立了 chIL-9检测方法。同时,为了后续研究chIL-9在疾病中的作用,本课题也制备了针对chIL-9Rα蛋白的单克隆抗体,并鉴定了 chIL-9Rα天然蛋白。研究结果为深入研究chIL-9在鸡免疫相关疾病中的作用以及新型免疫佐剂的开发奠定了理论基础。1.chIL-9的重组表达与生物学活性分析根据NCBI上的chIL-9基因序列（Genbank登录号:AM773755.1）设计特异性引物,以外周血单个核细胞（PBMC）cDNA为模板,扩增了 chIL-9基因编码区序列。克隆的chIL-9基因序列由417个核苷酸组成,可编码138个氨基酸,信号肽位于前20个氨基酸,理论分子量大小为13.6kDa（不含信号肽）。氨基酸序列比对及进化分析表明,chIL-9与哺乳动物IL-9氨基酸同源性低于30%,并与虎皮鹦鹉形成一个远离哺乳动物的进化簇。RT-qPCR检测组织分布显示,chIL-9 mRNA仅在鸡的睾丸和胸腺中大量表达,在激活的脾细胞中高表达。将去信号肽的chIL-9序列克隆到原核表达载体pET-32a上,经IPTG诱导成功获得表达,重组chIL-9（Trx-chIL-9）以包涵体形式表达,大小为32 kDa,经纯化、复性得到可溶蛋白;将chIL-9全长基因克隆到真核表达载体pEGFP-C上,转染至DF-1细胞,获得分泌表达的重组chIL-9蛋白（rchIL-9）,大小为15～25 kDa;用去糖基化酶处理发现,真核表达的rchIL-9是N-糖基化蛋白;将rchIL-9蛋白分别与单核/巨噬细胞、PBMC共培养测定其生物学活性,发现rchIL-9蛋白能激活单核/巨噬细胞,也能促进CD3+T细胞增殖;此外,rchIL-9也能上调PBMC、脾细胞和胸腺细胞的核转录因子PU.1、炎症因子IL-1β mRNA的表达,并能调控IFN-γ、IL-2、IL-7及IL-9 mRNA的表达水平。这些结果表明,原核或真核表达的rchIL-9在体外具有生物学活性,并具有促进鸡Th9细胞分化的潜力。2.重组chIL-9在体内的生物学活性与影响为了进一步测试重组chIL-9在体内的生物学活性,将不同剂量的原核rchIL-9蛋白处理雏鸡,分析了其对雏鸡增重的影响;在不同时间点采用多色流式细胞术和RT-qPCR分析体内T细胞亚群的动态变化以及细胞因子表达变化。结果显示,rchIL-9蛋白的处理并不影响鸡的增重率。但rchIL-9能诱导鸡外周血中CD4 T细胞数量和百分率的增加,CD8 T细胞数量和百分率的减少;在处理后在不同时间点可引起γδ T细胞亚群（CD8α+、CD4-CD8-、CD4+）数量和百分比不同程度的增加;在处理前期引起外周血和脾脏的自然杀伤（NK）细胞数量的减少,后期增多。qPCR结果显示,rchIL-9处理后可下调PBMC和脾细胞IL-1β mRNA的表达,上调PBMC和脾细胞PU.1因子mRNA水平,并能调控IFN-γ、IL-2及IL-7细胞因子mRNA的表达。这些结果表明,rchIL-9在体内具有促进CD4 T细胞的扩增和调控细胞因子表达的功能。3.chIL-9的多克隆抗体与单克隆抗体制备及其检测方法的建立以原核rchIL-9蛋白为免疫原制备了针对chIL-9蛋白的兔多克隆抗体（pAb）,其效价可达1:2×105;通过杂交瘤技术制备了 14株针对chIL-9蛋白的鼠源单克隆抗体（mAb）,分别命名为 1C7、1D4、1D7、1F7、1F10、2B2、2B12、3H5、4F7、5B3、5B8、5B9和5D2;除mAb 1D4、1F7为IgG2a外,其余mAb均为IgGI亚类,所有单抗的轻链均为κ链;所制备的单抗腹水效价均在1:105～107之间。免疫细胞化学（ICC）及Western blot（WB）结果显示,所有14株单抗均能特异性识别真核或原核表达的rchIL-9蛋白;进一步鉴定发现,兔多抗和mAb 3H5、4F7、4H7和5B8能较好地识别天然的chIL-9蛋白,以及分泌到胞外的成熟chIL-9蛋白,大小为25 kDa。流式细胞术分析发现,所有14株单抗均能通过胞内细胞因子染色法检测真核表达的rchIL-9蛋白,但只有mAb 1C7、1F10和5D2能特异性检测到激活的脾细胞中表达的天然chIL-9,其检测频率仅为0.14%。以5B8单抗为捕获抗体,生物素化的1F7单抗为检测抗体,建立了 chIL-9抗原捕获ELISA方法。试验的最佳条件为:5B8单抗包被浓度为10μg/mL,4℃包被12h,0.5%BSA为封闭液和检测抗体稀释液,1F7-biotin单抗工作浓度为1 μg/mL。根据标准曲线,该方法的检测极限为1.5 ng/mL,在3～100 ng/mL区间存在近似线性关系。该方法不与鸡IL-4、TGF-β1、IFN-γ或IL-2细胞因子发生交叉反应,具有特异性。利用此方法检测真核转染DF-1细胞上清中的rchIL-9含量,其含量可达400 ng/mL;在PMA/Ionomycin激活的脾细胞（4×107个细胞,48 h）上清中,chIL-9的含量可达12ng/mL。抗chIL-9兔多抗和单抗的制备以及chIL-9检测方法的建立为深入研究chIL-9在疾病中的作用提供了工具基础。4.chIL-9受体α链的单克隆抗体制备及鉴定为了辅助研究chIL-9在疾病中的作用,本研究也克隆分析了 chIL-9Rα,并制备了其单克隆抗体。根据NCBI提供的chIL-9Rα预测序列（GenBank登录号:416587）设计引物,分别扩增了全长序列和胞外区序列。序列分析发现,chIL-9Rα与哺乳动物IL-9Rα氨基酸同源性低于25%,单独形成一个远离哺乳动物的进化簇。RT-qPCR结果显示,chIL-9Rα mRNA仅在心脏和激活的PBMC中大量表达。将chIL-9Rα胞外区序列分别克隆到pET-28a原核表达载体和pcDNA3.1真核表达载体上,获得了原核及真核重组表达。以原核重组chIL-9Rα蛋白为免疫原制备了 11株针对chIL-9Rα蛋白的单抗,分别命名为 1D9、2D9、2G5、3H6、4E1、4E4、4E6、4F5、4G10、4H10 和 5G5。除mAb 1D9为IgG2a外,其余mAb均为IgG1亚类,所有单抗的轻链均为κ链。ICC和WB结果显示,除mAb 4H10外,其余单抗均特异性识别重组chIL-9Rα蛋白。间接免疫荧光显示,2G5和5G5单抗可识别脾细胞表面的chIL-9Rα天然蛋白。WB检测显示,MSB-1细胞系表面也存在分子量为51 kDa的chIL-9Rα。重组chIL-9Rα蛋白和抗chIL-9Rα单抗的获得为进一步研究chIL-9的功能和作用机制提供了免疫学工具。