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肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化（EMT）是糖尿病肾病（DN)肾小管间质纤维化的主要细胞分子机制之一，在DN肾纤维化的发生发展中起着重要作用。但由于这一过程涉及多种细胞事件和分子介质的参与和相互作用，影响因素众多且作用复杂，故对其分子机制的认识仍十分有限。本实验目的是采用糖尿病（DM）大鼠模型和体外经高糖处理的大鼠原代肾小管上皮细胞，研究在高糖条件下肾小管上皮细胞中核转录共抑制因子SnoN(Ski-related novel protein N)的表达变化、与DN发病过程中肾小管EMT的关系及其表达的分子调控机制，探讨SnoN在DN肾小管间质纤维化发病机制中的作用。 本实验采用病理学、生物化学和分子生物学方法进行研究。用链脲佐菌素（STZ）尾静脉注射复制大鼠DM模型，分别于成模2周（w）、4w、8w、12w、16w和24w时处死，每组均设鼠龄匹配的正常对照组；部分DM大鼠从成模13w起，用精蛋白锌胰岛素治疗，以血糖控制在4~7mmol/L，尿糖阴性为准，分别于成模16w和24w时处死，同时设鼠龄匹配的正常对照组和DM组；应用生化方法测血糖、血肌酐和24小时（h）尿蛋白，计算肾脏指数；HE（hematoxylin and eosin）和PAS（p-aminosalicylic acid）染色光镜观察肾脏和胰腺形态学改变，间接免疫荧光检测胰腺组织胰岛素表达。并采用原代培养大鼠肾小管上皮细胞，从细胞形态、生长周期、上皮细胞标志性蛋白细胞角蛋白-18（CK-18）、E-钙黏素（E-cadherin）和间质细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等方面鉴定所培养细胞；原代培养的肾小管上皮细胞分三组：①对照组：DMEM（含糖5.5 mmol/L）+2％FBS培养，②高渗组：19.5mmol/L D-mannitol+ DMEM+2% FBS培养，③高糖组：19.5mmol/L D-glucose+DMEM+2%FBS培养，每组设30分钟（min）,2h,12h,24h,48h,72h和96h七个时间点进行观察； Western blot、免疫组织化学、免疫细胞化学和RT-PCR技术，动态观察SnoN、转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smads、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）/细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）信号通路及E3泛素连接Smurf2(Smad ubiquitination regulatory factor2)和APC（anaphase promoting complex）在各组大鼠肾组织和高糖培养大鼠原代肾小管上皮细胞中的表达；并应用siRNA技术敲低SnoN表达，进一步明确SnoN在DN肾小管EMT发生中的作用。 本实验研究结果显示，在整个实验期间，注射STZ大鼠血糖持续在高水平，从2w开始即出现血肌酐，24h尿蛋白及肾脏指数的明显增加；病理观察发现，注射STZ大鼠胰岛结构严重破坏，胰岛素分泌显著减少，肾组织出现炎细胞浸润和纤维化表现；这些结果表明本实验成功复制了大鼠DM模型。培养细胞呈典型铺路石样生长，CK-18和E-cadherin蛋白呈阳性表达，且几乎看不到α-SMA蛋白阳性表达，表明原代培养细胞是肾小管上皮细胞。 研究结果发现，SnoN、TGF-β1、Smad2/3、HGF、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、Smurf2和APC在大鼠肾小管上皮细胞中均有表达；与正常对照组相比，DM大鼠肾组织和高糖处理肾小管上皮细胞中SnoN蛋白表达减少；随DM病程进展和高糖培养时间延长，DM大鼠肾组织和肾小管上皮细胞中FN蛋白和mRNA表达增多。控制血糖能上调DM大鼠肾小管上皮细胞SnoN蛋白和mRNA表达，下调FN蛋白表达，并伴有尿蛋白和血肌酐的降低及肾纤维化的改善；高糖转入正常糖培养能显著上调肾小管上皮细胞SnoN蛋白和mRNA表达，下调FN蛋白表达。研究还发现，高糖抑制体内外肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达的同时，能增加肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad2/3、phospho-Smad2和phospho-Smad3蛋白的表达，增强TGF-β1/Smads信号的活化，诱导体内体外肾小管EMT的发生；相关性分析发现，高糖条件下，SnoN与CK-18和E-cadherin呈显著正相关，与α-SMA表达呈显著负相关；且siRNA抑制SnoN表达，可使高糖诱导的肾小管上皮细胞CK-18和E-cadherin蛋白表达减少、α-SMA蛋白表达增加。DM大鼠肾组织和高糖培养肾小管上皮细胞中SnoN mRNA表达与正常组相比差异无统计学意义，高糖能增加体内外肾小管上皮细胞中HGF、ERK1/2、phospho-ERK1/2的表达；研究还发现，与同时间点正常大鼠肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞中的表达量相比，高糖能增加体内外肾小管上皮细胞中E3泛素连接酶Smurf2和APC10蛋白表达。 研究结果表明，（1）高糖抑制体内外肾小管上皮细胞中SnoN蛋白表达；（2）SnoN蛋白参与了DN发病过程中肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化；（3）高糖环境中肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达减少不是由其基因转录的改变引起的；可能与E3泛素连接酶Smurf2和APC介导的SnoN蛋白泛素化降解有关。 综上所述，在DN肾小管间质纤维化的发生发展机制中，高糖抑制了肾小管上皮细胞中SnoN蛋白表达，而SnoN蛋白表达减少参与了高糖诱导的肾小管EMT过程，是DN肾小管间质纤维化发生的主要机制之一，该发现对阐明DN发病机制有重要意义。研究还发现，发现高糖环境中肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达减少不是由其基因转录的改变引起的，可能与E3泛素连接酶Smurf2和APC介导的SnoN蛋白泛素化降解有关。E3泛素连接酶介导的泛素化讲解可能是DN发病中肾小管上皮细胞中SnoN蛋白表达减少的主要原因之一。