猪链球菌病是一种重要的人兽共患传染病,可以引起脑膜炎、败血症、心内膜炎和关节炎等疾病。近年来由于抗生素滥用等原因,菌株对抗生素呈现严重耐药和多重耐药,给该病的防控带来了困难。探索新的治疗方法尤为迫切,其中基于噬菌体的治疗策略再次引起关注。噬菌体治疗技术的关键在于细菌裂解作用,现有研究认为：噬菌体裂菌的生物化学基础是其编码的“穿孔素(holin)-裂解酶(lysin)"系统。而目前国内外对猪链球菌噬菌体裂菌机制的研究较为鲜见。为此在本实验室前期研究的基础上,进一步研究噬菌体穿孔素的亚细胞定位、膜拓扑结构以及不同位点氨基酸对穿孔素定时裂菌功能的影响,研究结果对深入揭示基于穿孔素的裂菌机制具有重要意义。为了确定穿孔素的亚细胞定位情况,选择绿色荧光蛋白作为示踪分子。首先把gfp基因插入到pET-32ai(+)载体中,构建质粒p32G。然后利用DNA重组技术将gfp基因与holin基因的N-端通过不同长度的linker进行连接,获得单一的融合基因表达载体p32GH。将构建的质粒p32G和p32GH分别转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS细胞,阳性重组菌加入DiI染料培养,并经IPTG诱导后采用共聚焦显微镜观察。结果显示只表达GFP的菌株,其绿色荧光弥散分布于整个细胞；而gfp与holin基因融合表达的菌株,绿色荧光则集中分布于细胞膜上。上述结果表明穿孔素holin定位于细菌细胞膜上。同时发现不同长度的linker对穿孔素的定时裂解功能影响很大。为了揭示穿孔素holin的膜拓扑结构,采用半胱氨酸定点突变扫描技术(SCAM)解析了穿孔素上的关键氨基酸在膜内外的分布情况。在综合三种膜蛋白预测软件解析结果的基础上,在穿孔素不同的区域各选择一个位点突变为半胱氨酸,重组突变菌株用巯基试剂MPB进行原位标记,然后用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)进行检测。结果显示这七个突变菌株,虽然只改变了一个氨基酸,但对其功能影响却很大。通过分析这七个突变菌株,发现G35C、T80C、Y105C三个位点分布在细胞膜内,分别参与形成三个跨膜区,与基于生物学软件预测的结果一致。为了进一步研究基于穿孔素蛋白的裂菌机制以及每个跨膜区之间氨基酸的相互作用。在穿孔素蛋白编码序列已知的基础上,选择不同位点的核苷酸进行突变,从而改变编码的单个氨基酸,重组突变菌株与野生菌株相比仅改变了穿孔素上的一个氨基酸,经诱导表达后测定其生长曲线,发现跨膜区的基因突变对穿孔素蛋白功能影响比较显著。同一个氨基酸突变为不同的氨基酸,对生长曲线并没有规律性的影响。但不同位点的甲硫氨酸全部突变为亮氨酸,生长曲线却有显著差异。而且,每个突变菌株与全长穿孔素重组菌pEXH1相比,裂菌时间均有变化,表明穿孔素蛋白的裂菌功能对其编码序列十分敏感。综上可见,猪链球菌噬菌体的穿孔素holin定位于细胞膜；属于Ⅰ型穿孔素蛋白,具有三个跨膜区,蛋白N-端和C-端均位于细胞膜外侧；穿孔素蛋白的功能对其编码序列十分敏感,尤其是跨膜区序列。通过对穿孔素蛋白膜拓扑结构的初步解析,将为深入揭示穿孔素触发裂菌的分子机制,开发基于噬菌体的治疗技术提供理论依据。