增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是在玻璃体和视网膜前后表面形成纤维增殖膜，由于膜的收缩和牵拉引起视网膜脱离（retinal detachment，RD）为特征的一类眼病。PVR是孔源性视网膜脱离最严重的并发症之一，其发展过程包括早期的细胞移行，细胞增殖，细胞外基质的重塑和纤维细胞膜的形成和收缩，引起视网膜结构明显的变形，造成视网膜复位手术的失败，最终导致严重的视功能丧失或失明。PVR也是严重眼外伤、血管性视网膜病变的常见并发症。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞作为最关键细胞，贯穿于PVR发生、发展的所有过程。PVR病理上分为三个阶段：第一阶段RPE等细胞移行至视网膜前和视网膜下，开始增殖；第二阶段包括RPE等细胞大量增殖和细胞外基质的重塑；最后阶段纤维增殖膜形成并收缩导致RD。过多地纤维细胞膜的增殖被认为是伴随RPE细胞参与和细胞外基质重塑的一种创伤修复过程。一旦孔源性视网膜脱离中的RPE细胞从基底膜上播散下来，它的性质就变得像体外培养的成纤维母细胞一样活跃。临床上一直沿用的治疗PVR的方法是玻璃体视网膜手术，手术技术的飞速发展提高了视网膜复位率，但术后往往由于再次发生PVR，导致RD复发，严重影响患者视功能。因此，选择安全有效的药物早期防治PVR是一项既迫切又有广泛前景的任务。现在，无论在临床上还是动物实验中，药物防治PVR日益成为研究的热点。迄今为止眼科界所研究用于PVR的药物不下几十种，这些药物主要为西药，虽然抗增殖作用强大，但作用单一，且可能存在一定细胞毒性，一直未能应用于临床。中药具有药源丰富、作用多样且毒副作用小等众多优点，从理论上有很好的应用前景。一种从植物中提取的天然中药姜黄素进入我们视线。姜黄素是从植物姜黄（Curcuma longa）中提取的一种天然有效成分。它具有抗癌性、抗炎性、抗血管化、抗氧化、抗风湿和抗转移等多种功效，在内科及抗肿瘤疾病中研究颇多，但是在眼科领域国内外报道为数不多。同时，近年来的实验研究多限于针对RPE细胞自身增殖的研究，对于RPE和其生物活性息息相关的微环境----细胞外基质的相关特性目前还不十分明确或者报道的较片面。因此，本课题分别通过体外和体内实验研究姜黄素这种中药对人RPE细胞移行的抑制作用和对人RPE细胞外基质的重塑的影响，并选取了先前研究中防治PVR效果显著的药物----维甲酸作为对照研究。积极从细胞外基质方面，探讨姜黄素和维甲酸这两种药物如何来阻止RPE细胞产生PVR的行为，为PVR防治提供新思路。第一部分姜黄素和维甲酸抑制人视网膜色素上皮细胞移行的体外和体内实验研究目的：研究不同剂量的姜黄素和维甲酸对体外培养的人RPE细胞移行的影响，评价姜黄素和维甲酸在人RPE细胞移行中的作用，并筛选出这两种药物抑制人RPE细胞移行的最佳药物浓度。将最佳浓度的姜黄素和维甲酸分别作用于RPE细胞诱导的兔眼PVR模型，评价两种药物对RPE细胞在体内侵袭能力的影响。方法：采用胰蛋白酶消化法体外分离、培养人RPE细胞，免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定。取第4⁶代生长状态良好的RPE细胞用于实验。以MTT法检测不同浓度姜黄素(0、0.25×10^-5、0.5×10^-5、1.0×10^-5、2.0×10^-5、4.0×10^-5M)和不同浓度维甲酸(0、10-6、10^-5、10-4、10-3M)作用48h后对人RPE细胞增殖的影响。通过计算48h作用时间后姜黄素和维甲酸的半数抑制率（the half maximal inhibitory concentration,IC50）。筛选合适浓度的姜黄素和维甲酸作用人RPE细胞，分别通过划痕实验，transwell侵袭实验，3D胶原胶收缩实验和体内RPE细胞的侵袭实验，探讨姜黄素和维甲酸在人RPE细胞移行中的作用。结果：初分离的人RPE细胞呈球形，多数细胞胞质中布满黑色素颗粒，在培养48～72h内贴壁，培养后7d细胞达融合，传代细胞24h贴壁。传至第4代细胞黑色素颗粒明显减少，免疫细胞荧光化学染色法提示细胞S-100抗原和角蛋白（cytokeratinAE1/AE3）抗原均表达阳性。姜黄素和维甲酸的IC-550分别是：1.2×10M和10-2.77M。划痕实验中：0、10-6、10^-5和10-4M的维甲酸和0、0.25×10^-5、0.5×10^-5、1.0×10^-5M的姜黄素分别作用于人RPE细胞，维甲酸和姜黄素对细胞的迁移均有抑制作用，且呈浓度依赖性；transwell细胞侵袭实验中：0、10-6和10-5M的维甲酸和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黄素分别作用于人RPE细胞48h，维甲酸和姜黄素对细胞的侵袭均有抑制作用，且呈浓度依赖性；3D胶原胶收缩实验中：0、10-6和10-5M的维甲酸和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黄素分别被加入含有2×105RPE的胶原胶的混合物中，连续观察96h，维甲酸和姜黄素对胶原胶的收缩均有抑制作用，且呈浓度依赖性；RPE细胞体内侵袭实验中：0、0.5×10-5M姜黄素和10-5M维甲酸各100μl和100μl含2×106第6代RPE混合液（共200μl）分别注入兔眼玻璃体腔，连续观察4周。与对照组比较，姜黄素和维甲酸能显著地抑制PVR的形成。结论：通过体外培养的方法可获得大量人RPE细胞，用于体外和体内实验研究；结合MTT实验、划痕实验、transwell侵袭实验、3D胶原胶的收缩模拟实验和RPE细胞体内侵袭实验数据，0.5×10-5M的姜黄素和10-5M的维甲酸对体外培养和注入兔眼内的人RPE细胞的移行能力有显著地抑制作用，并且48h的时间观察点被作为合适的实验条件确定下来，将应用于进一步的实验。第二部分姜黄素和维甲酸对体外培养的人视网膜色素上皮细胞外基质和粘附分子mRNA水平的影响目的：通过观察姜黄素和维甲酸对体外和体内人RPE细胞移行的影响，应用基因芯片和实时定量PCR（real-time PCR）检测姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子mRNA表达的影响，探讨姜黄素和维甲酸影响人RPE细胞外基质重塑的因素及作用机制。方法：选取第9代生长状态良好的人RPE细胞用于本研究。通过人的细胞外基质和粘附分子PCR芯片技术描述0.5×10-5M的姜黄素和10-5M的维甲酸干预后人RPE（1×107）48h后细胞外基质和粘附分子基因表达图谱。并与不加任何药物的空白对照组进行比较。结果：与对照组比较，84个被检测的基因中，与姜黄素相关的17个基因的mRNA显著下调，10个显著增加（P <0.05）；与维甲酸相关的有24个基因，其中20个基因的mRNA显著下调，4个显著增加（P <0.05）。结论：姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子的mRNA的表达影响是显著的，有选择性的，并有类似的作用机制。这两种药物共同抑制基质金属蛋白酶（Matrix Metallo Preteinases，MMP），如MMP1，MMP2，MMP9；大多数的胶原蛋白；纤粘连接蛋白1（Fibronectin1）和层粘连蛋白等；共同增强MMP3和一些整合素的表达。相比较而言，在调节MMP3、MMP9和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue Inhibitor ofMetalloproteinase1, TIMP1）的mRNA表达上，姜黄素比维甲酸的作用更强，更系统化。第三部分姜黄素和维甲酸对体外培养的人视网膜色素上皮细胞外基质和粘附分子蛋白质水平的影响目的：通过观察姜黄素和维甲酸对体外和体内人RPE细胞移行能力的影响和细胞外基质基因的表达，应用western blotting测定姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子中部分相应蛋白质表达的影响，探讨姜黄素和维甲酸重塑人RPE细胞外基质的影响因素及作用机制，探讨蛋白质与基因的表达是否一致。方法：选取第9代生长状态良好的人RPE细胞用于本研究。通过western blotting描述0.5×10-5M的姜黄素和10-5M的维甲酸干预人RPE（1×107）48h后细胞外基质和粘附分子蛋白质的表达。并与不加任何药物的空白对照组进行比较。结果：与对照组比较，0.5×10-5M的姜黄素显著地抑制纤维粘连蛋白1，MMP1，MMP2和MMP9蛋白质的表达，增强MMP3蛋白质的表达；而10-5M的维甲酸显著地抑制纤维粘连蛋白1，MMP1，MMP2，MMP9，MMP14，整合素ITGAM和ITGB2，增强了MMP3和钙粘连蛋白-E蛋白的表达；姜黄素和维甲酸比较，姜黄素对MMP3蛋白质表达的作用较强。结论：姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子的蛋白质表达影响是显著的，有选择性的，并有类似的作用机制。这两种药物共同抑制MMP1，MMP2，MMP9，纤粘连蛋白1（Fibronectin1）等；共同增强MMP3的表达。姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子蛋白质的调节与对基因的调节是一致的。第四部分姜黄素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响目的：观察人视网膜色素上皮细胞内钙离子的变化，探讨不同浓度姜黄素干预后，在人视网膜色素上皮细胞和其基质间可能存在的相关信号转导作用机制。方法：对各组第6代人RPE细胞进行5μM Fluo-3负载30min，姜黄素分别以0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M浓度干预人RPE细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定各组RPE细胞内早期钙离子的荧光变化。结果：LSCM检测结果：0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M姜黄素组RPE细胞内均有钙荧光。空白对照组钙荧光强度明显低于姜黄素各组，细胞内钙离子的荧光强度与姜黄素的刺激浓度呈正相关（r=0.922, P＜0.05）。结论：体外培养的人RPE细胞经不同浓度姜黄素干预后，较空白对照组，早期细胞内钙离子荧光强度明显增加。结合四部分的实验数据，我们推断当细胞受到姜黄素外界信号刺激时，细胞内钙离子浓度能迅速增加，继而传递信号，重塑细胞外基质，引起细胞的生物学效应。