研究背景人星状病毒(Human Astrovirus, HAstV)首次于1975年由Appleton和Higgins用电镜检测胃肠炎患儿粪便标本时发现。星状病毒属单独的星状病毒科,星状病毒属,无衣壳单股正链RNA病毒。病毒颗粒直径约28 nm,由于电镜下病毒颗粒呈星形,因此被Madeley和Cosgrove命名为星状病毒。病毒基因全长618 kb,包含有三个开放阅读框架(open reading frames):ORF1a、ORF1b、ORF2。ORF1a、ORF1b在5’端,为高度保守区域,主要编码蛋白酶及RNA多聚糖；ORF2在3’端,基因长度为2388 kb,为多变区,该区域主要编码衣壳蛋白；此外,基因组还包括一个5’非编码区与一个3’端非编码区及一个约30个核苷酸的多聚核苷酸尾。HAstV是引起婴幼儿腹泻的最主要的病原之一,对志愿者和自然感染者的研究均证实它与腹泻密切相关。世界各地均已有HAstV感染的报道,既可散发也可以引起暴发流行,亦可引起医源性感染。与轮状病毒相似,HAstV感染多发生在2岁以内尤其是1岁以内的婴幼儿。住院腹泻患儿中HAstV检出率为2.5%-9.0%,目前被认为是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因,仅次于轮状病毒。此外,老年人和免疫缺陷患者也是HAstV感染的高危人群,人类免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生该病毒感染均已有报道。HAstV亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一。应用多克隆抗体和单克隆抗体,可将HAstV划分为8个血清型。HAstV广泛分布于世界各地,各血清型流行情况因地区和流行年不同而有所不同,其中多以血清型1型为主。HAstV感染具有较明显的季节性,一般在温带地区的流行季节为冬季,而在热带地区的流行季节则为雨季。HAstV血清流行病学的研究显示,5岁儿童抗1型HAstV的IgG抗体阳性率达90%,说明儿童5岁以前对HAstV已有广泛的接触。人们先后从猫、羊、猪等动物粪便中及淤泥、湖水中分离出了星状病毒,Miossee报道曾从甲壳类水生物中分离出该病毒,提示星状病毒有可能像甲型肝炎病毒一样通过甲壳类水生物传播。简便、快速地检测HAstV,一直是人们研究的课题。目前检测HAstV常用的方法有：1.电镜法(electronic microscope):Appleton等于1975年首次用电镜发现了HAstV,此后十多年时间里,电镜是检测该病毒的主要方法。此方法形象、直观,但仅有10%的星状病毒具有典型的星形外观,故敏感性较低。若在标本中加入荧光标记的抗体,可提高检出率,称为免疫电镜法。当病毒滴度低时,免疫电镜法仍有较高的假阴性,且由于价格昂贵,技术条件要求高,不适合大规模的流行病学调查。2.细胞培养(cell culture)和病毒分离(virus separate):1977年Lee和Kurtz采用人胚肾细胞成功分离了HAstV。1990年Willcocks等采用传代细胞系人类结肠癌细胞(CaCo-2)直接从腹泻标本中分离出HAstV,且HAstV于CaCo-2细胞内增殖良好,这使HAstV的检测方法发生了里程碑的进步。人们可利用增殖的病毒制备不同血清型的单克隆抗体,这为以后应用酶免疫法进行大量流行病学调查奠定了基础,正因为如此,星状病毒腹泻才逐渐为大家所认识和重视。3.酶免疫法(enzyme immunoassay, EIA)及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA):Herrmand等在成功制备HAstV单克隆抗体的基础上建立了EIA和ELISA,该法操作更简单,具有更好的敏感性及特异性,并能进行分型。但用于检测的单克隆抗体在商业上往往很难获得且价格昂贵,故作为常规检测方法在目前有较大的困难。4.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR):随着对星状病毒培养、分离及测序的成功,星状病毒的RT-PCR检测法也就应运而生。从1993年开始,RT-PCR就应用于检测星状病毒,并与EIA进行了对比,发现RT-PCR法比EIA有更高的敏感性及特异性,不受难以获得的血清抗体的限制,故目前大多数星状病毒的报道均是用该法进行研究。5.血清学检测：HAstV血清学检测方法包括免疫电镜(IEM)、放射免疫法(RIA)、免疫荧光法(IFA)、酶免疫法(EIA)等。血清学检测方法可帮助了解HAstV感染状况,目前认为其特异性抗体仅具有部分保护作用,故现在开展得较少。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由日本荣研株式会社的Notomi等2000年开发出来的一种新型的核酸扩增方法。LAMP的反应原理是利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的内引物(FIP由Flc和F2组成；BIP由B1c和B2组成)和外引物(F3和B3),特异地识别靶序列上的6个独立区域,在60-65℃恒温条件通过循环链置换反应,形成含有若干交替重复的茎环结构的DNA。LAMP法利用酶反应系统直接扩增靶核酸序列,能使靶核酸序列呈指数级扩增,在45-60min的时间里可达到109-1010数量级；反应过程不需控制温度的变化,在恒温水浴加热即可进行,省去了昂贵的热循环仪的费用。由于两对引物在靶基因上的6个不同部位完全匹配才能进行扩增,所以LAMP法具有很高的特异性。在DNA合成时,从脱氧核酸三磷酸基质(dNTP)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应,产生大量焦磷酸镁白色沉淀,因此可以把浑浊度作为反应的指标,仅用肉眼观察白色浑浊沉淀就能鉴定扩增与否,而不需要繁琐的电泳和紫外观察。有时,通过肉眼观察白色沉淀来判断会存在一定的误差,日本荣研株式会社利用LAMP反应过程中产生焦磷酸镁白色沉淀,研制出专门用于LAMP检测的实时浊度仪,以实现对LAMP扩增过程的实时监控,使扩增和检测同时完成。此外,还可通过添加荧光染料,如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenⅠ等进行染色,来检测扩增是否发生。LAMP反应的最终扩增产物是分子量大小不等的茎环DNA组成的混合物,在2%的琼脂糖凝胶上电泳呈现的是典型的梯状条带。LAMP法由于具有操作简便易行、特异性高、结果判断简单等多方面的优点,故本法一经面世就被应用到很多方面,包括人类、动物和植物致病微生物的检测、动物胚胎性别的鉴别和转基因食品的检测等。研究目的建立一种快速检测人星状病毒1型的环介导等温扩增方法。研究方法1.标本的收集1份HAstV-1型和1份札幌病毒GⅡ型阳性粪便标本来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,2份诺如病毒GⅡ型、3份轮状病毒A组阳性粪便标本由本实验室保存,80份腹泻患者粪便标本于2006年8月至2007年1月期间收集于江门市妇幼保健医院儿科门诊,以及江门市人民医院急诊科和腹泻门诊。收集的粪便标本用PH7.2的PBS配制成悬液保存于-40℃。2.引物设计针对编码非结构蛋白的基因组保守区域ORF1a,通过ClustalW2在线软件比对GeneBank上已公布的ORFla序列确定LAMP目标序列,输入在线软件Primer Explorer V4设计出特异的RT-LAMP引物,其序列(5’-3’)为：F3:GCATTATCTTCTTGTGCTTCA; B3:TCACGGATCTCGAACCTG;FIP:CCACCAGCAATTAATACTGCTGTAGGAAGACTCCAACTATGTGAGC;BIP:GCACGACCACGTCATTGTTTCAATGAAAACAGTTGCCATAC.3.RNA的提取用Trizol法从收集的粪便标本提取RNA并溶于DEPC处理水,测定其230nm、260 nm、280 nm和310 nm的OD值,保存于-80℃。4. RT-LAMP条件优化、产物的检测和酶切鉴定反应体系置60℃恒温反应45min、60min、75min、90min,最后80℃孵育5min以灭活酶终止反应。产物通过凝胶电泳后溴化乙锭染色紫外线下观察,以及荧光染料SYBR Green I染色后肉眼观察。对RT-LAMP产物进行切胶、称重,经凝胶回收试剂盒纯化回收后用限制性内切酶TaaI进行切割,凝胶电泳观察酶切片段。5. RT-PCR和RT-LAMP检测HAstV-1型的特异性、敏感性分析5.1以RT-LAMP的外引物F3、B3作为RT-PCR的上、下游引物进行RT-PCR扩增,对其产物进行切胶、称重,经凝胶回收试剂盒纯化回收后,与pMD18-T载体连接,转化至感受态大肠杆菌DH5a。通过蓝白斑筛选试验挑出白色菌落接种到含Amp的LB液体培养基震荡培养,再提取质粒DNA作模板用引物F3、B3进行PCR扩增来鉴定筛选正确的克隆。测定质粒溶液230 nm、260 nm、280nm和310 nm的OD值,将浓度为2.3×108copies/μl质粒DNA溶液保存于-20℃备用。5.2 1份HAstV-1型、1份札幌病毒GⅡ型、2份诺如病毒GⅡ型、3份轮状病毒A组阳性粪便标本作为检测对象,提取RNA同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测。5.3 HAstV-1型阳性标本所提取RNA的一系列稀释度为：1ng/μl, 100pg/μl, 10pg/μl,1pg/μl,100fg/μl,10fg/μl,分别作模板用RT-LAMP和RT-PCR检测。5.4质粒DNA浓度按10×梯度稀释,其浓度为2.3×107copies/μl到23copies/μl,并作模板用LAMP和PCR检测。6.检测临床腹泻患者粪便标本80份非细菌性腹泻患者粪便标本提取RNA后,同时用RT-LAMP和RT-PCR检测。研究结果1.各反应时间的RT-LAMP产物电泳呈特征性梯状条带,其中90min产物条带较明显,以90min为最佳反应时间。2. RT-LAMP产物加入荧光染料,管中反应液变绿,呈阳性结果；阴性对照管和空白对照管保持橙色,呈阴性结果。3.用限制性内切酶Taal切割其产物,结果显示酶切片段与预期值(206,225,244 bp)相符。4. RT-LAMP和RT-PCR分别检测HAstV-1型均呈阳性,而其他病毒株均呈阴性。5. RT-LAMP检测HAstV-1型RNA下限为5 pg/管,LAMP检测重建质粒的下限为230 copies/管；RT-PCR和PCR则为50 pg/管和2.3×103 copies/管。6. RT-LAMP和RT-PCR分别检测80份临床腹泻患者粪便标本,其中3份均呈阳性,其余均为阴性。两种方法检测结果一致。结论本研究建立的RT-LAMP方法检测HAstV-1型的特异性和敏感性较好,且反应耗时较短,实用性强,适合于基层实验室和现场的应用。