兔出血症是家兔的一种烈性传染病,以发病急、传播速度快、死亡率高为特点,并主要感染3月龄以上成年兔,曾给养兔业造成巨大的经济损失。几年以前,通过疫苗注射可较好地控制本病。但是近年来,3月龄以下、甚至2月龄以下幼兔时有发病,给该病的防控提出了新问题。究竟是抗原变异的原因还是免疫程序的问题需要进一步研究。本研究首先对华东三省RHD的病原进行了分子流行病学调查,对三个分离毒株的基因序列、致病性和免疫原性进行了比较,研究了幼兔出血症的免疫程序,并探讨了中药佐剂对疫苗的免疫增强作用和作用机理。本研究的目的,旨在寻找理想的免疫程序和疫苗佐剂,为幼兔出血症的防控提供理论依据。具体内容为以下五个部分:试验Ⅰ、华东三省RHDV的分子流行病学调查为了弄清兔出血症病毒的流行规律,从2005年到2007年对山东、江苏、安徽三个养兔大省的家兔的带毒情况进行了调查。首先建立了RHDV RT-PCR检测方法,按照GenBank上公布的RHDV基因序列设计一对引物,以RHDV发病兔的新鲜兔肝为材料,提取总RNA,进行cDNA的合成和PCR扩增,对扩增产物进行克隆测序,扩增出与预期的269bp大小一致的片段,该产物序列与公布的RHDV基因序列有95.8%～98.5%的同源性。然后对RT-PCR方法的敏感性、特异性和RHDV的脏器分布进行试验。结果表明,RT-PCR方法的敏感性是HA的1×10~4倍,对RHD发病死亡兔,能从除粪便以外的各种脏器中检测到病毒。运用建立的RT-PCR方法对采集的不同日龄段的兔鼻拭样品和出入境兔肉产品进行检测,同时选择数个分离毒株进行测序和序列比较。结果,400份出入境兔肉产品中没有发现阳性样品,512份鼻拭子中有48份阳性样品,表明兔出血症病毒在华东三省广泛存在,不同日龄段兔之间的带毒率存在显著性差异;而不同年份、不同省份兔之间带毒率差异不显著;序列比较结果发现三株不同序列,其与Genbank上已公布序列的同源性为93.7%～99.6%。试验Ⅱ、幼兔RHDV三个分离株的基因序列、致病性和免疫原性比较为了研究幼兔RHDV与疫苗株RHDV的区别,应用RT-PCR技术对幼兔RHDV的3个分离株(HN、SH、DY株)和疫苗对照FY株进行RT-PCR扩增,同时进行VP60序列测定、序列比对和蛋白质同源性分析;用4个毒株对兔只进行攻毒,记录死亡时间和死亡率,比较致病性差异;用4个毒株制成疫苗,免疫家兔,比较其免疫原性。结果,3个分离株的基因序列同源性为95.2%～97.4%,氨基酸同源性为95.8%～99.3%;4个毒株的致死率、致病病程和病毒血凝性没有显著性差异;4个疫苗免疫后产生的抗体为同一血清型,各个疫苗均可以抵抗其它毒株的攻击,表明幼兔RHDV的3个分离株与疫苗株之间的免疫原性无显著差异。试验Ⅲ、免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平产生的影响试验1通过攻毒实验比较了新西兰家兔0、1、2、3和4log2 5种抗体水平对的病毒性出血症(RHD)的保护效果,结果表明,抗体效价高于3 log2时可产生100%的保护,2 log2的保护率仅为50%。试验2测定了30、35、40、45、50、55和60日龄非免疫兔的母源抗体效价和用RHD组织灭活苗免疫后8周内血清抗体效价的动态变化,结果发现,母源抗体与日龄呈负相关,在30日龄时最高,可以产生有效的保护,在40日龄后已无保护作用;免疫日龄与抗体峰值和有效保护时间呈正相关,30日龄免疫,抗体效价不但不升、反而显著下降,无保护作用;35日龄免疫,抗体峰值较低,有效保护时间仅为2周;大于40日龄免疫,抗体峰值较高,有效保护时间延长。试验Ⅳ、幼兔出血症免疫程序的研究试验1选择35、40、45三种日龄新西兰家兔各30只,每个日龄兔随机均分为5组,对照组注射生理盐水,4个试验组分别注射4种剂量(1mL、2mL、3mL、4mL)的兔病毒性出血症疫苗,对照组注射生理盐水,分别于免疫前及免疫后1～7周内采血测定血清抗体效价的动态变化。结果表明,各日龄兔的2mL、3 mL、4 mL剂量组的抗体上升速度和有效抗体维持时间均显著大于同日龄的1 mL剂量组;35日龄兔的2 mL、3 mL、4 mL剂量组的抗体峰值显著高于1 mL剂量组。35日龄一次性注射疫苗2mL,其抗体效价在多数时间点显著高于二次注射1mL疫苗的抗体效价。试验2比较两种免疫程序的免疫效果,结果表明,1次性免疫2mL组的抗体水平在大多数时间点显著高于两次免疫1mL组。以上结果提示35日龄免疫、注射剂量2 mL为最佳免疫程序。试验Ⅴ、中药佐剂对RHD疫苗的免疫增强作用为了增强兔出血症疫苗的免疫效果,选择4中药成分(黄芪多糖,淫羊藿多糖,蜂胶黄酮,人参皂甙)组成2个复方,分别与兔出血症疫苗混合后免疫幼兔,以铝胶苗和无佐剂苗为对照,分别于免疫后7、14、21、28、35、49天采血,用微量血凝法测定血清抗体的动态变化,用MTT法测定外周血T、B淋巴细胞转化的动态变化;于免疫后63天测定免疫器官指数并进行攻毒试验。结果表明,复方1在部分时间点能显著提高血清抗体效价,复方2在多数时间点能显著提高血清抗体效价;两个复方在第7天显著促进T淋巴细胞转化,在第7～21天显著促进B淋巴细胞转化;两个复方显著增大圆小囊、肠淋巴结器官指数,提高保护率。试验Ⅵ、中药佐剂对淋巴细胞的转化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响为了进一步证实两个中药成分复方佐剂的免疫增强作用,并探讨其作用机理,比较了两个复方对培养的兔外周血淋巴细胞增殖的作用,运用荧光定量RT-PCR方法比较了两个复方对兔外周血淋巴细胞IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响。结果表明,两个中药成分复方在一定的浓度下可以显著促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-10 mRNA的表达。这可能是两个中药佐剂增强免疫的机理之一。