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选择适宜的种子细胞是细胞工程学研究的重要前提,原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)因其无限增殖和多向分化的能力而备受关注。传统的培养体系常常使用血清和饲养层为胚胎干细跑提供支持,但血清和饲养层含有大量成分复杂的异源蛋白和不利于细胞生长的抑制因子,具有潜在的细胞毒性,同时也给细胞产物的分离和细胞特化等调控机制的研究带来极大困难。本研究选用14-18 d胎龄的胎兔原始生殖细胞为研究对象,建立了一种无血清无饲养层培养兔原始生殖细胞的方法。1.本试验选取日本大耳白兔14-18 d胎龄胎兔无菌剥离生殖嵴,体外分离PGCs,使用KSR代替血清,在培养体系中添加细胞因子LIF制成无血清培养液对兔PGCs培养。采用酶组织化学检测碱性磷酸酶活性、RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达等方法对PGCs进行鉴定,探究了细胞传代数与冻存30天后的复苏率之间的关系。结果表明:(1)AKP染色与RT-PCR检测结果均为阳性,说明使用添加了LIF的培养液可成功培养兔PGCs。(2)冻存30天后无血清培养方法的复苏率与常规培养无差别(P>0.05);2.本试验使用无血清培养体系下的兔PGCs,进行条件培养基的过渡培养,之后在添加LIF、b FGF、TGF-β1的无血清无饲养层培养条件下培养,通过RT-PCR检测不同代数和培养天数的PGCs转录因子Oct-4的表达,体外拟胚体的形成实验,冻存30天后的复苏培养探究了无血清无饲养层培养兔PGCs的方法,结果表明:(1)兔原始生殖细胞可通过条件培养基的过渡培养成功进行无血清无饲养层的培养;(2)在无饲养层无血清培养液中添加LIF、b FGF、TGF-β1三种细胞因子可以使兔原始生殖细胞持续增殖并保持全能性;(3)冻存30天后无血清无饲养层培养的复苏率与常规培养并无差异(P>0.05)。