CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

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目的:  本实验将体外研究CGRP对骨髓间充质成骨分化的影响,并探究其在成骨分化过程中的作用机制,为进一步研究神经因素在牙周组织再生中的作用提供理论支持。  方法:  1.不同浓度CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞增殖作用的影响:  1)体外培养大鼠间充质干细胞。采用Realtime-PCR及Western Blot方法检测CGRP受体CRLR和Ramp1。  2)CCK-8法检测不同浓度CGRP(0、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L)对细胞增殖能力的影响,同时确定CGRP拮抗剂8-37的拮抗浓度。  2.CGRP对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响:  1)体外矿化诱导大鼠BMSCs。实验分为四组即:空白对照组;CGRP组(10-8mol/l);8-37组(10-7mol/1); CGRP+8-37组(10-7mol/18-37+10-8mol/1 CGRP)。  2)应用Realtime-PCR、Western Blot、ALP方法检测Runx2、BSP、ALP mRNA和蛋白的表达水平。  3)通过茜素红染色及钙离子浓度测定四组细胞晚期成骨分化能力。  结果:  1.原代和传代后的大鼠骨髓间充质干细胞生长良好。  2.大鼠间充质细胞CGRP受体的表达:  可见大鼠间充质细胞中存在CGRP受体RAMP1及CRLR的mRNA和蛋白的表达。  3.细胞增殖的情况:  与对照组相比,10-9~10-6mol/1 CGRP均可以促进细胞增殖(P<0.05),而10-8~10-6mol/1 CGRP对细胞的增殖作用较为明显,故选取最低有效浓度10-8mol/1作为CGRP实验浓度。  加入受体拮抗剂8-37后,于3、5天检测吸光度,10倍到100倍的受体拮抗剂作用较强(P<0.05),各组间无统计学差异,故选取10倍8-37作为拮抗剂浓度。  4.CGRP矿化诱导rBMSCs后ALP、Runx2、BSP蛋白和mRNA表达的影响:在1天、5天时,对照组Runx2、BSP、ALPmRNA和蛋白的表达均低于其他三组(P<0.05),且CGRP组成骨相关因子的表达明显高于其他三组(P<0.05)。  5.CGRP对rBMSCs矿化结节形成的影响:  细胞矿化诱导三周,茜素红染色,CGRP组染色面积最大,空白对照组染色面积最小。钙离子浓度结果:空白对照组钙离子浓度明显低于其他三组,有统计学意义(P<0.05)。同时,CGRP组高于CGRP+8-37组和8-37组(P<0.05),而后两组无明显差异。  结论:  1.大鼠间充质干细胞中存在CGRP的受体CRLR和Ramp1。  2.适宜浓度的CGRP可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。
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