急性肾损伤（Acute Kidney Injury，AKI）是临床各科室常见急、危、重症,肾后性因素是导致AKI的一个重要的原因，主要是因为尿路梗阻引起排尿障碍、梗阻上方压力增高，导致尿液逆流入肾内产生肾实质损害和肾功能障碍并最终导致肾功能衰竭的一种常见疾病。肾后性AKI发病机制目前未完全清楚，大多数学者认为本病是以梗阻为始动因素所诱导的多种血管活性物质、生长因子、细胞因子、化学趋化蛋白、反应氧代谢产物参与肾间质炎症、肾小管凋亡和间质纤维化导致肾小管萎缩、间质纤维化和肾单位的丧失[1]。本实验以双侧输尿管梗阻模拟肾后梗阻性急性肾损伤，输尿管梗阻时，梗阻部位以上压力增高，肾盂积水内压逐渐增高，压力经集合管传至肾小管和肾小球，使肾小球滤过率减少，肾实质逐渐萎缩变薄，导致急性肾损伤[2]。因此，肾后性AKI治疗应尽早明确诊断，及时解除梗阻，恢复尿流，恢复肾功能。肾功能修复阶段中，各种相关的生长因子和化学趋化蛋白参与修复过程。表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）是一种多功能的细胞因子，主要由颌下腺、腮腺、胰腺、肾脏、十二指肠、前列腺和脑等部位合成，通过自分泌或旁分泌的方式分泌在大多数体液、分泌液及组织中。EGF配体与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）结合后，介导细胞增殖、分化，细胞运动迁移、血管生成、抗凋亡等[3、4]。研究显示在多种原因诱导的急性肾损伤模型中，外源性EGF能够抑制肾小管上皮细胞凋亡、介导近端小管上皮去分化，促进肾小管上皮细胞再生与修复，促进肾功能的恢复[5-8]。单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是相对分子质量为8-10kD，属于趋化因子β亚家族，可由多种细胞产生，包括成骨细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、单核／巨噬细胞和某些肿瘤细胞，肾脏的固有细胞上也有MCP-1的表达[9、10]。MCP-l与单核细胞趋化蛋白受体CCR2结合后经G蛋白信号转导，通过磷脂酰肌醇途径发挥生物学效应。MCP-l的主要生物学效应是：①对单核／巨噬细胞有较强的诱导和趋化作用；②趋化和激活嗜碱性粒细胞，使其释放组胺参与免疫调节；③诱导单核细胞粘附并浸润动脉壁，与动脉粥样硬化的形成关系密切；④参与细胞的生长、代谢和凋亡过程；⑤对T细胞具有趋化和激活的双重作用[11-13]。正常情况下，MCP一1表达水平较低或不表达，但当受到缺血、缺氧等因素刺激时，其表达上调，并在白细胞向炎症部位趋化和随后的活化过程中起重要协同作用。国内外主要研究肾前性及肾性AKI的一些修复机制，对肾后性AKI再通的修复作用研究较少，国内外主要集中在再通后水盐代谢方面的研究，国外有学者研究肾后性梗阻再通后生长因子的表达情况，探讨其修复机制，国内这方面研究较少[14、15]。基于EGF、MCP-1可作为AKI的早期生物学标记物，本研究拟通过建立成年大鼠BUO模型，测试在梗阻解除后的不同时间点EGF和MCP-1的变化情况，评价EGF和MCP-1在梗阻及再通后肾脏的表达情况，探讨其修复机制。以期找到BUO导致急性肾损伤的修复过程中的关键环节，可能为将来肾后性急性肾损伤的治疗提供新的策略参考。研究目的通过免疫组化染色及病理图像分析软件观察各组肾组织EGF、MCP-1表达情况，探讨EGF、MCP-1在双侧完全输尿管梗阻再通后的修复机制。材料及方法主要材料：6-8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，200-250g，广东省医学实验动物中心提供；Anti-EGF antibody（兔抗鼠多克隆抗体），BOSTER公司提供；Anti-MCP-1antibody （兔抗鼠多克隆抗体），BIOSS公司提供；GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒，DakoCytomation公司提供。1.方法1）分组：实验大鼠随机分成五组，每组8只大鼠：假手术组（A组）、BUO24h组（B组）、BUO24h再通1d组（C组）、BUO24h再通4d组（D组）、BUO24h再通7d组（E组）。2）动物模型建立：采用V管卡压法输尿管结扎术，大鼠购买后，SPF级实验室中安静饲养七天预适应后，五组的大鼠均用10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉后，取仰卧位，腹正中线行2.5-3.5cm切口，打开腹腔，经腹暴露左侧肾盂输尿管连接部（PUJ），在PUJ下方1cm处游离一段长约5mm的输尿管段，将长约1.8cm的硬膜外麻醉用塑料导管对折成V型（V管），轻轻套卡在左输尿管上，用1号丝线结扎V管两末端令输尿管官腔夹闭，注意线结与末端之间仅保留1-2mm的距离，按照同样方法结扎右侧输尿管，缝合肌肉和皮肤。模型组24h后，同前法麻醉后再次按原路径打开腹腔，暴露梗阻部位，可看到V管上段输尿管扩张，表明造模成功，剪断结扎在V管上的丝线，轻轻取下V管，解除梗阻。假手术组大鼠仅游离出双侧输尿管，不结扎双侧输尿管，缝合切口。3）数据收集:假手术组和各模型组分别在24小时梗阻再通0h、1d、4d、7d心脏穿刺取血后全部处死，留取左肾组织做石蜡切片。3000转/分高速离心10分钟后留取血清，保存于-20℃冰箱，留测血清肌酐。左肾组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋以做常规HE染色和EGF及MCP-1免疫组织化学染色。利用DS-Ri1光学显微镜采图，每张切片取5个高倍镜视野，每个视野>500个细胞，分别计算阳性率，阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%，取平均值，数据用mean±SD表示结果，比较各组大鼠肾组织损伤评分，EGF及MCP-1的表达差异。4）统计方法：用SPSS17.0统计分析软件分析，所有数值用均数±标准差（X±S）表示，采用完全随机设计的方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。结果1、大鼠双侧输尿管梗阻24h肌酐及尿素氮显著升高，而随着梗阻再通时间的延长，其数值又逐渐下降，至再通7天时，尿素氮及肌酐值逐渐下降，约降至正常水平。2、光镜：假手术组肾组织无明显改变；双侧输尿管梗阻24h后各模型组发生急性肾损伤，表现为肾小管上皮细胞空泡样变性，部分肿胀、坏死，小管腔明显扩张，肾小管损伤积分较高，腔内可见脱落细胞，肾组织间质水肿及炎症细胞浸润，再通1天后肾脏得到部分恢复，至第7天肾脏组织表现为轻度损伤，显示基本恢复正常，肾小管积分逐渐下降。3、大鼠双侧输尿管梗阻24h后，肾组织MCP-1免疫组化染色示：在正常对照组未见明显表达，梗阻24h组视野可见大量阳性表达的肾小管上皮细胞，随着梗阻再通时间的延长，有阳性表达的肾小管上皮细胞逐渐下降，至再通第7天时仅有散在的阳性表达的肾小管上皮细胞。4、肾组织EGF免疫组化染色结果示：在正常对照组中可见表达阳性的髓袢升支厚段及远曲小管的上皮细胞，梗阻24h组可见少量弱阳性的肾小管上皮细胞，与对照组相比明显下降，梗阻再通1d时阳性的肾小管上皮细胞较前增多，随着再通时间的延长，阳性细胞逐渐增多，至第7天达最高。结论1、双侧输尿管夹闭法（V管夹压法）成功制作了肾后性急性肾损伤动物模型；V管夹压再通模拟了临床上手术解除梗阻；2、梗阻再通后，EGF表达增加，提示可能参与急性肾损伤的修复；3、梗阻再通后，MCP-1表达下降，表明可能参与急性肾损伤的修复。