第一部分 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抗流感病毒机制研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)最初是从小鼠肺条件培养液中发现的一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的因子。随着对其研究的深入,发现除了促进造血祖细胞的增殖和分化,GM-CSF对成熟白细胞的功能也有激活作用,有助于增强机体的抗感染免疫。本研究在前期的工作中首次证实GM-CSF对FM1流感模型小鼠有显著的保护作用,经(GM-CSF预防治疗后,能明显降低流感模型小鼠肺流感病毒滴度,减轻肺组织病变,提高模型小鼠的生存率,该研究结果已于2010年发表于《Cytokine》杂志上。为了在已有的药效学研究基础上进一步阐明(GM-CS F抗流感病毒的确切机制,本论文第一部分从炎症和细胞凋亡两方面对此进行了较为系统的实验探索。沿用之前的预防治疗方式,经滴鼻途径给予BALB/C小鼠GM-CSF7天,剂量为1.34mg/kg/day,然后再对小鼠感染致死量的A型流感病毒FM1,并于感染病毒的第0天、第2天和第4天各选取一定数量的小鼠进行解剖,收获肺标本,分别用ELISA法检测肺匀浆中的细胞因子,流式细胞术检测肺组织内免疫细胞的占比,real-time RT PCR技术检测肺组织内A型流感病毒M基因、NF-κB、caspase 3、bax 和 bcl-2 mRNA表达水平,Western bl ot检测NF-κ κB、磷酸化NF-κB、IκB、caspase 3、cleaved caspase 3、bax 和 bcl-2蛋白表达水平,免疫组化检测肺组织石蜡切片中磷酸化NF-κB和cleaved caspase 3的定位表达。数据显示,经GM-CSF预防治疗后的小鼠肺TNF-α和FNα/β生成量显著增加,在病毒感染早期肺组织内的天然免疫细胞的数量占比也高于模型对照组,而之后这些细胞因子浓度和粒细胞、单核/巨噬细胞数量占比下降,均低于模型对照组,该结果表明GM-CSF预防治疗可以在病毒感染初期显著上调机体的抗感染免疫水平并在之后控制机体的免疫应答强度。感染第2天和第4天的A型流感病毒M基因定量分析显示GM-CSF治疗组均显著低于模型对照组,该结果提示GM-CSF对肺流感病毒载量的有效抑制作用,这可能与GM-CSF及早启动抗病毒免疫应答,控制了病毒的复制和扩散有关。NF-κB是调控炎症因子和干扰素表达的重要因子,检测表明小鼠经GM-CSF预防干预后,肺NF-κB mRNA和磷酸化NF-κB蛋白表达增加,并且在感染流感病毒后也稳定在相当水平,而模型组小鼠肺NF-κB mRNA和磷酸化NF-κB蛋白水平在感染病毒后大幅上升,显著高于GM-CSF干预组。对细胞凋亡相关因子的检测表明,GM-CSF可以增加抑凋亡因子bcl-2的表达,抑制促凋亡因子bax、caspase 3 和 cleaved caspase 3的表达,提示(GM-CSF对流感病毒诱导的细胞凋亡具有抑制作用。根据上述实验结果我们推测(M-CSF对流感模型小鼠的保护机制：(1)GM-CSF通过激活NF-κB信号途径,促进肺抗病毒细胞因子TNF-α和Ⅰ型IFN生成,并且在感染早期有效募集天然免疫细胞,从而控制了病毒的复制和扩散。由于病毒载量的显著抑制,使得炎症反应和免疫应答一直控制在适度水平,从而避免了炎症性病理损伤的发生；(2)GM-CSF上调抑凋亡因子bcl-2和下调促凋亡因子bax的表达,抑制caspas e信号途径的激活,显著减少了流感病毒诱导的肺细胞的凋亡和由此导致的严重肺损伤。简言之,(GM-CSF的预防干预使机体抗感染免疫水平在感染之初即显著上调,及早启动的抗病毒免疫应答,有效控制了流感病毒的复制和扩散,避免了因高病毒载量导致的过度炎症反应和凋亡的发生,从而有效保护了流感病毒感染小鼠。该研究结果为GM-CSF应用于流感的预治提供了理论基础。第二部分 恩替卡韦与黄芩苷组合物抗乙肝病毒药效学研究黄芩苷(baicalin,BA)是从唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,药理作用广泛,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、解热、镇静、降压等功效。体外实验表明,黄芩苷对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制有一定抑制作用,而黄芩苷药物作为乙肝治疗的辅助用药在临床上亦有不错的疗效,但是有关黄芩苷抗乙型肝炎病毒的机制尚未见文献报道。本论文首次对黄芩苷抗乙肝病毒的作用机制进行了探索。分别以黄芩苷50μM、25μM和12.5μM作用于HepG2 2.2.15细胞模型,采用ELISA和real time PCR方法分别检测细胞上清中HBV抗原和HBV DNA水平,结果显示黄芩苷对HBsAg.HBeAg和HBV DNA均有一定抑制作用。Northern blot和real time RT PC R检测表明黄芩苷显著减少HepG2 2.2.15细胞内的HBV 2.1/2.4kb和 3.5kb RNA表达水平,同时发现黄芩苷显著下调宿主细胞的肝细胞核因子HNF1α和HNF4α的表达,而HNF 1α和HNF4α都是HBV RNA转录的正调控因子,由此推测黄芩苷可能通过下调HNF 1α和HNF4α的表达,抑制HBV RNA的转录生成,继而影响病毒蛋白的表达和HBV DNA的合成,从而抑制HBV的复制。本研究又将恩替卡韦(entecavir,ETV)与黄芩苷配伍,分别在HepG2 2.2.15细胞模型和通过对HBV进行rtM204V+rtL180M突变(YMDD主要突变类型之一)并建立的拉米夫定耐药细胞模型中考察了恩替卡韦黄芩苷组合物(ETV+BA)对野生型HBV及拉米夫定耐药突变HBV的抑制效果。结果表明,在HepG2 2.2.15细胞模型中,组合物ETV3nM+BA50μM、ETV0.75nM +BA50μM和ETV0.19nM+BA50μM对野生型HBV的HBsAg.HBeAg和HBVDNA的合成均显示显著的抑制作用,较之单独使用ETV干预,对HBsAg抑制率分别提高35.05%、35.67%和39.44%,对HBeAg抑制率分别提高10.99%、12.45%和12.46%,对HBV DNA抑制率分别提高10.66%、13.19%和12.17%。而在HBV拉米夫定耐药细胞模型中,组合物ETV 48nM+BA 50μM、ETV 16nM+BA 50μM、ETV 3nM+BA50μM和ETV 0.75nM+BA50μM也显示对HBV rtM204V+rtL180M突变株的显著抑制作用,较之单独使用ETV干预,对HBsAg抑制率分别提高30.00%、30.00%、29.58%和32.92%；对HBeAg抑制率分别提高28.88%、31.08%、32.67%和30.94%；对HBV DNA抑制率分别提高37.60%、41.00%、35.80%和33.88%。以上数据表明,相比单独使用ETV干预,ETV+BA组合物可以提高对野生型HBV和拉米夫定耐药突变HBV抑制效果,这可能与ETV和BA具有不同抗病毒机制有关,两个药物同时作用可以从多靶点抑制HBV的复制,ETV主要通过影响病毒聚酶活性抑制HBV DNA的复制,而BA则通过下调HNF 1α和HNF4a表达影响HBV RNA的合成,两者配伍组合后,作用机制上的互补使得抗HBV效果得以提升。另外,由于HBV YMDD变异株对ETV敏感性减弱,而BA的作用靶点是宿主的肝细胞核因子,抗HBV效果不受病毒变异影响,使得ETV+BA组合物对HBV YMDD突变株的抑制效果提升更为显著,提示ETV+BA组合物在治疗HBV拉米夫定耐药株感染方面可能更具优势。本研究还采用口服给药方式在鸭乙肝动物模型中进一步检测了该配伍组合在体内的抗HBV疗效。通过斑点印迹杂交和Southern印迹杂交检测治疗后的鸭血清和肝脏DHBV DNA水平。结果显示,组合物ETV O.lmg/kg/d+BA 250 mg/kg/d 和 ETV 0.025mg/kg/d+BA 250mg/kg/d治疗13天后,鸭血清DHBVDNA水平分别53.61%和46.96%,比单独使用ETV治疗的抑制效果分别提高14.74%和15.03%；鸭肝DHBV DNA水平分别下降72.6%和62.83%,比单独使用ETV治疗的抑制效果分别提高8.60%和19.24%,表明ETV+BA组合物在体内同样抗HBV作用显著,并且比单独ETV治疗具有更好的抗病毒疗效。这些发现对提高抗乙肝病毒疗效和克服核苷类药物的耐药等具有重要意义,并且为开发核苷类药物与天然产物的组合新药奠定了实验室研究基础。