论文部分内容阅读
目的：蛋白磷酸酶4(Protein phosphatase4, PP4)是PP2A家族的重要成员,参与调节许多重要的细胞进程,如中心体的成熟、微管的组织和生长、DNA损伤修复,并与胰岛素受体底物4(Insulin receptor4, IRS4)的降解和肝糖代谢有关。本研究通过建立TNF-a诱导的胰岛素抵抗的细胞和动物模型,分析细胞或肝脏组织中PP4的表达及活性的变化,探讨PP4在TNF-a诱导的肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制。方法：TNF-α(10ng/ml)刺激人肝癌细胞系HepG2和C57BL/6小鼠原代肝细胞24h,建立胰岛素抵抗的细胞模型；C57BL/6小鼠背部皮下埋植TNF-a(8μg/kg-day)缓释泵处理7天,建立TNF-a诱导的胰岛素抵抗动物模型。用G418筛选得到稳定转染PP4高表达质粒HA-PP4和转染PP4活性抑制突变体质粒FLAG-PP4RL的HepG2细胞克隆；应用PP4-siRNA及PP4-shRNA干扰HepG2细胞与原代肝细胞中PP4的表达,获得PP4低表达的HepG2细胞和原代肝细胞；构建PP4-shRNA腺病毒载体,通过尾静脉注射C57BL/6、鼠,建立肝脏PP4低表达的动物模型。测定小鼠血糖、血脂、胰岛素和TNF-a水平。用蒽酮法检测细胞和肝脏组织中的糖原水平,Real-time PCR测定糖异生相关基因(G6Pase、PEPCK、PGCl-α)的表达,Western blot分析细胞或肝脏组织胰岛素信号通路中JNK、P-JNK、IRS1、P-IRS1、AKT、P-AKT、GSK、P-GSK和PP4的水平,用免疫沉淀结合丝／苏氨酸磷酸酶活性分析法测定PP4的活性。免疫共沉淀结合Western blot检测PP4与IRS1的相互作用。结果：1.我们首先以2型糖尿病小鼠-db/db小鼠(C57BKS/J背景)为胰岛素抵抗模型,检测到血糖、胰岛素和TNF-a水平显著升高,而胰岛素敏感指数(ISI)降低。蒽酮法检测结果显示肝组织糖原含量显著降低,Western blot结果表明糖原合成和糖异生相关信号通路受损：JNK的磷酸化和IRS1的307-Ser磷酸化水平增强,而GSK、AKT的磷酸化水平下降,同时伴有IRS1表达下降及PEPCK表达增加。这些结果表明db/db小鼠的肝脏发生了胰岛素抵抗。我们还观察到db/db小鼠肝组织中PP4的表达和活性均显著增强,提示PP4可能参与了肝脏胰岛素抵抗的发生。在体外试验中,我们采用10ng/mlTNF-a处理HepG2细胞和C57BL/6小鼠原代肝细胞24h,建立胰岛素抵抗细胞模型。在这两种细胞的胰岛素抵抗模型中,糖原含量显著下降,糖异生相关基因表达增加,细胞的糖原合成信号通路受损： JNK的磷酸化和IRS1的307-Ser磷酸化水平升高,而GSK和AKT的磷酸化水平下降。Western blot和磷酸酶活性分析结果显示PP4的表达和活性均增强。在TNF-a诱导的C57BL/6小鼠胰岛素抵抗动物模型中,血清胰岛素水平升高,ISI降低,肝脏组织中糖原含量显著下降,糖异生相关基因(G6Pase、PEPCK、PGC1-a)的mRNA水平升高。肝脏组织的糖原合成信号通路受损：IRS1和JNK的磷酸化水平显著增加,而GSK和AKT的磷酸化水平及IRS1表达水平显著降低。同时肝脏组织PP4的表达和活性增强。细胞和动物实验结果均提示PP4参与了TNF-a诱导的肝脏胰岛素抵抗的发生。2.为了进一步探讨PP4在TNF-a诱导的肝脏胰岛素抵抗中的作用及机制,我们针对PP4的表达和活性,分别建立了稳定高表达PP4以及PP4活性被抑制的HepG2细胞克隆,应用PP4-siRNA及PP4-shRNA获得PP4低表达的HepG2细胞和原代肝细胞以及肝脏PP4低表达的C57BL/6小鼠。这些细胞和动物的分析结果表明①PP4高表达的HepG2细胞中糖原含量降低,糖原合成信号通路受损；②PP4表达降低可以使HepG2细胞、原代肝细胞以及C57BL/6小鼠中糖原含量增加,糖异生相关基因表达降低,糖原合成信号通路恢复；③抑制PP4活性,HepG2细胞的糖原合成增加,糖原合成信号通路得以恢复。此外,免疫共沉淀及Westernblot的结果显示,在HepG2细胞和原代肝细胞中PP4与IRS1存在着相互调节作用。这种相互调节可能在TNF-a诱导的肝脏胰岛素抵抗中起关键作用。结论：1.在肝胰岛素抵抗的细胞和动物模型中,PP4的表达和活性均显著增强；2.PP4是TNF-α信号通路的正调控因子,促进TNF-α诱导的胰岛素抵；3.PP4通过两种方式参与TNF-α诱导的胰岛素抵抗。一方面,通过激活JNK调控胰岛素信号通路；另一方面,可能通过与IRS1直接作用而调节TNF-α诱导的胰岛素抵抗。