研究背景胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）是一种起源于胆道的恶性肿瘤。胆管癌占所有胃肠道肿瘤的3%。在全球范围内,肝脏及胆道的恶性肿瘤占癌症相关死亡的13%;其中10%-20%属于胆管癌。胆管癌患者的平均诊断年龄为50岁。胆管癌的全球发病率差异很大。在过去的30年里,胆管癌的发病率正在逐渐的上升,特别是在东亚和东南亚,胆管癌的发病率正在不断攀升。在胆管癌中,根据肿瘤的解剖位置,胆管癌可进一步分为肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）、肝 门 部 胆 管 癌（perihilar cholangiocarcinoma,PHCC）和远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,DCC）。三种不同类型的胆管癌的危险因素、分子发病机制、生物学特点、临床特点和治疗策略各不相同。肝内胆管癌位于肝脏的实质内。二级胆管是肝内胆管癌与肝门胆管癌分界点,胆囊管与肝总管的交汇处是肝门部胆管癌与远端胆管癌的解剖学边界。由于胆管癌的解剖位置特殊,临床症状出现较晚,胆管癌的诊断对于临床工作者来说是一项很大的挑战。正因如此,胆管癌的患者通常诊断较晚,而且预后较差。肝门部胆管癌是胆管癌中最常见的类型,占了所有胆管癌的50%以上。唯一可能治愈胆管癌的方法就是根治性手术切除。但对于肝门部胆管癌来说,由于第一肝门的解剖比较复杂,根治性手术是非常困难的。尽管手术技术和辅助治疗有了显著的改善,但肝门部胆管癌的预后仍然很差（大多数研究中5年生存率<30%）。以第二代测序为代表的技术革命为肿瘤治疗的分子特征和治疗策略提供了更多的方案。这对于胆道的恶性肿瘤,包括胆管癌尤其重要,因为超过65%的胆道恶性肿瘤患者在诊断时已经丧失了获得根治性手术切除的机会。综合遗传分析的新证据揭示了胆管癌的几种突变,如成纤维细胞生长因子受体（FGFR）融合重排和异柠檬酸脱氢酶（IDH）-1和异柠檬酸脱氢酶（IDH）-2突变。尽管肝门部胆管癌的发病率在三种类型的胆管癌中最高,但对其分子模式和特点的研究却落后于肝内胆管癌。自2007年以来,第七届美国癌症/国际癌症控制联盟（AJCC/UICC）已将肝门胆管癌和远端胆管癌定义为不同类型的肝外胆管癌,但迄今为止,还没有研究将肝门部胆管癌作为一种单独的癌症类型进行全面的遗传分析。在所有胆管癌中,Kirsten ras肉瘤病毒致癌基因同源突变（KRAS）和FGFR2融合是已经明确的体细胞遗传改变。KRAS突变预示着较差的总生存率,一些证据表明FGFR2融合在胆管癌的肿瘤发生和发展中起到不可忽视的作用。FGFR2是一种酪氨酸激酶受体,它主要了参与细胞增殖等过程,这种作用主要通过激活包括Ras/Raf/MEK/MAPK和PI3K/AKT信号通路的多种下游通路。RAS参与了 FGFR2介导的信号通路,其常见的下游信号通路是MEK/MAPK通路。KRAS突变和FGFR2融合均可以刺激MEK/MAPK通路,这种异位激活最终导致肿瘤细胞的过度增殖。细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）是大家熟知的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）之一,是KRAS和FGFR2的主要下游效应因子。研究者们普遍认为RAS激活可以启动补偿反馈机制,从而减弱信号输出。Sprouty（SPRY）家族包括SPRY1-4,是Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路中最重要的负调控因子。SPRY可以通过从不同的水平调节FGFR/Ras/Raf/MEK/MAPK通路来抑制ERK的磷酸化。据报道,SPRY的功能障碍会导致多种癌症的进展,包括胃癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌。然而新的证据表明,SPRY家族成员的表达是肿瘤特异性的,并不是所有的SPRY家族成员都参与了不同类型癌症的进展和预后。比如说SPRY2是人类上皮性卵巢癌的独立预后生物标志物,而SPRY4没有这种作用。此外,SPRY4的缺失增强了急性髓性细胞白血病中的RAS信号,而SPRY家族中的其他成员没有这种作用。在我们之前的研究中,我们证明了不同的SPRY家族成员在肝内胆管癌中有不同的表达情况,SPRY2可以通过拮抗FGFR2信号来抑制肝内胆管癌的进展。然而,SPRY家族在肝门胆管癌中的表达、功能及临床意义还是一个谜。在我们的研究中,我们研究了不同SPRY家族成员在肝内胆管癌,肝门部胆管癌和远端胆管癌中的表达,来确定在肝门胆管癌细胞中影响Ras/Raf/MEK/MAPK信号反馈的关键效应因子,并通过分析临床病理因素与生存时间的相关性来评估其临床意义。通过体内外实验,我们进一步评价了 SPRY4在肝门胆管癌进展中的抑瘤作用,并探讨了 SPRY4抑制肝门胆管癌进展的潜在机制。第一部分Sprouty家族在胆管癌内的表达情况及临床意义目的:肝门部胆管癌是一种预后很差的消化系统恶性肿瘤。根据解剖位置,我们将胆管癌分为肝内胆管癌,肝门部胆管癌及远端胆管癌。肝门部胆管癌（PHCC）是胆管癌（CCA）三种亚型中最常见的类型。在我们之前的研究中,我们探究了肝内胆管癌（ICC）中SPRY的表达情况,但SPRY家族成员在肝门部胆管癌中的表达及临床意义尚不清楚。在本部分的研究中心,我们将探究SPRY家族成员在不同类型的胆管癌中的表达,研究SPRY家族成员与胆管癌患者临床病理特征和预后的关系。方法:我们首先收集了 2007年至2018年在山东大学齐鲁医院因肝门部胆管癌接受手术治疗的424例患者的信息。进一步选择142例接受根治性手术切除的患者作为本次研究的队列。收集胆管癌患者的癌组织及相邻的正常组织,通过qRT-PCR检测SPRY家族成员（SPRY1-4）在不同类型胆管癌（肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌）及相应邻近组织中的表达。应用免疫组织化学方法检测142例肝门部胆管癌患者SPRY家族的表达情况。采用Kaplan-Meier法绘制了患者的生存曲线,采用log-rank检验比较患者生存率的差异。采用单因素和多因素分析,研究SPRY4与肝门部胆管癌患者临床病理情况的关系,探究SPRY4的临床意义。结果:在肝内胆管癌中,肿瘤组织中SPRY2的mRNA水平明显低于对应的癌旁组织。而在肝门部胆管癌中,SPRY2的表达在肿瘤组织和对应的相邻组织间无明显差异。在肝门部胆管癌中SPRY1、SPRY3、SPRY4在肿瘤组织中的表达明显低于对应的相邻组织。我们还应用免疫组化的方法检测了 142例肝门部胆管癌患者肿瘤组织中SPRY1-4的表达情况,并根据SPRY1-4的评分将其分为不同的亚组。所有SPRY家族成员均在细胞质中表达,其中SPRY1和SPRY4在肝门部胆管癌中的表达相对高于SPRY2和SPRY3。在4个SPRY家族成员中,SPRY4是唯一的肝门部胆管癌预后良好的标志（P=0.006）。SPRY4的高表达预示着更长的生存期。在我们本部分的研究中,除了 SPRY4的表达情况外,患者的年龄大于65（P=0.013）、淋巴结转移的阳性（P=0.025）、远处转移的阳性（P<0.001）、TNM分期为晚期（P<0.001）均与低生存率显著相关。SPRY4的高表达预示着肝门部胆管癌患者的肿瘤体积更小（P=0.007）、淋巴浸润为阴性（P=0.031）和TNM分期更早（P=0.002）。结论:SPRY4是SPRY家族4个成员中唯一与肝门部胆管癌预后相关的成员,SPRY4的高表达是判断肝门部胆管癌预后良好的独立的生物学标志物。第二部分Sprouty4的表达通过阻断FGFR-ERK通路及阻断细胞周期预示着肝门胆管癌的良好预后目的:在前一部分中,我们发现SPRY4的高表达是判断肝门部胆管癌预后良好的独立的生物学标志物,但是机制尚未明确。SPRY家族被认为是ERK激活的负性调节因子,我们推测SPRY4可能通过抑制ERK的激活来影响细胞的功能从而影响肝门部胆管癌患者的预后。在这一部分中,我们的目的是探究肝门部胆管癌中SPRY4和FGFR家族之间的相关性。探讨SPRY4在肝门部胆管癌中的作用,以及SPRY4预示肝门部胆管癌预后良好的机制。方法:用免疫组化法检测肝门部胆管癌中FGFR1-4的表达,分为低表达和高表达。我们进一步检测SPRY4和FGFR家族之间的相关性。通过体内实验及体外实验探究SPRY4在FGFR介导的肝门部胆管癌细胞增殖和迁移中的作用。免疫蛋白印迹法检测8对新鲜肝门部胆管癌组织及对应的邻近正常组织中SPRY4的表达。在肝内胆管癌细胞系RBE、HCCC-9810、肝门部胆管癌细胞系FRH0201、QBC939中检测SPRY4表达含量。在QBC939细胞系中,应用shRNAs沉默SPRY4,在FRH0201中,用携带LV5-SPRY4的慢病毒过表达SPRY4。应用QBC939细胞系评估SPRY4对增殖和迁移的影响。建立具有SPRY4敲除的稳定的QBC939细胞和具有SPRY4过表达的稳定的FRH0201细胞,并注射到裸鼠皮下,成功成瘤。我们进一步研究了在FGFR和ERK抑制剂存在的情况下,SPRY4对FGFR诱导的ERK磷酸化和细胞周期的影响及其机制。结果:FGFR2和FGFR4的高表达提示肝门部胆管癌的预后较差。在肝门部胆管癌中,SPRY4的表达与FGFR2的表达密切相关,其表达可由FGFR2异位激活引起。肝内胆管癌细胞系RBE、HCCC-9810、肝门部胆管癌细胞系FRH0201、QBC939均可检测到SPRY4的表达,其中以QBC939细胞表达最为显著。CCK-8和集落形成实验均显示,SPRY4敲低显著促进了 QBC939细胞的增殖,而SPRY4的过表达促进了 FRH0201细胞的增殖。穿孔实验和划痕实验也获得了类似的结果,表明SPRY4在QBC939细胞的迁移中也发挥了重要作用。通过体外和体内实验,我们发现SPRY4通过抑制ERK磷酸化来抑制FGFR介导的增殖和迁移。SPRY4基因敲除可降低G1期细胞的百分比,并促进S期和G2/M期细胞的百分比,这种作用是通过增加cyclin D1的表达来实现的,这种作用也需要FGFR介导的ERK磷酸化来完成。结论:肝门部胆管癌中FGFR2异位激活可诱导SPRY4表达。SPRY4通过抑制ERK磷酸化,在G1期阻滞细胞周期,抑制FGFR介导的增殖和迁移。SPRY4有希望成为肝门部胆管癌的潜在的治疗靶点。