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白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性疾病,因患者表皮进行性丢失功能性的黑素细胞(MC),而表现为患处皮肤出现大小不规则的白色斑片,严重影响患者容貌。由于本病病因不明,发病机制复杂,目前尚无十分有效的根治方案。因此,积极探索白癜风的发病机制,寻找恰当的治疗靶点,对最终攻克此病具有重要意义。大量研究证实,寻常型白癜风(VV)患者中存在细胞免疫功能的异常。患者外周血和皮疹局部皮肤中可检测出比例升高的MC特异性细胞毒性T淋巴细胞,同时,VV患者伴发其他自身免疫病(AID)的比率明显高于一般人群。但患者机体因何种原因丧失了对自身细胞的免疫耐受仍不得而知。调节性T淋巴细胞(Treg)具有免疫抑制作用,在维持机体免疫耐受中起重要作用,其数量减少和功能下降与多种AID的发生有关。初步的研究已发现VV患者外周血Treg的抑制功能低于正常人。那么,VV患者是否存在以Treg受损为特征的系统性的免疫调节机制异常,从而导致系统性效应T细胞(Teff)反应亢进,引起了包括MC在内的多个组织器官的免疫破坏,表现为VV伴发高比例的AID和变态反应性疾病(ALD)?目前国内外仍未有系统而深入的阐释。新近发现的炎症性Teff亚群—辅助性T细胞(Th)17和Th22参与了多种AID的发病,但两者在VV发病中的作用仍不清楚。VV中是否存在Teff/Treg失衡?Teff在VV患者MC功能破坏和凋亡中扮演何种角色?深入探索T细胞免疫功能对解开VV发病之谜具有十分重要的意义。本研究首先证实了在VV患者中有较高比例的患者伴发其他AID和ALD,最常伴发的疾病是自身免疫性甲状腺炎、慢性荨麻疹、支气管哮喘和系统性红斑狼疮(SLE),提示患者存在系统性的免疫反应亢进。其次,我们研究了VV患者中包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、Th17和Th22在内的Teff亚群及Treg细胞与病情进展的关系,证实了进展期患者存在Teff/Treg失衡。再次,我们研究了进展期患者体内升高的Teff亚群相关细胞因子对体外培养的MC合成黑素功能的影响以及诱导细胞发生凋亡的作用,发现干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-17和IL-22可不同程度地通过抑制MC的酪氨酸酶(TYR)和小眼畸形转录因子(MITF) mRNA的表达而对MC的黑素合成起抑制作用,另外,IFN-γ还可直接诱导MC凋亡。第一部分W患者伴发AID和ALD的流行病学调查目的：了解VV患者中其他AID和ALD的患病率方法：以调查表形式收集127例VV患者的临床资料,应用SPSS15.0软件对数据进行统计学分析。结果：127例VV患者中20(15.75%)例伴发其他AID,27(21.26%)例伴发ALD。其中自身免疫性甲状腺炎(13.39%)、慢性荨麻疹(11.02%)、支气管哮喘(6.30%)和SLE(0.79%)在VV中的患病率显著高于普通人群(P<0.05)。结论：VV患者中其他AID和ALD的患病率明显高于一般人群,提示VV可能与其伴发疾病有共同的发病基础,系统性的免疫反应亢进可能参与了VV的发病。第二部分VV患者Teff/Treg失衡目的：研究Teff亚群和Treg在VV中的变化情况,明确Teff/Treg失衡与VV病情进展的关系。方法：用流式细胞术检测50例VV患者和20例正常对照外周血中Teff亚群(Thl、Th2、Th17、Th22、Tcl、Tc2、Tc17、Tc22、CTL)以及Treg的百分率；用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Teff亚群和Treg相关细胞因子fIFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-17A、IL-22、IL-6、TGF-β、IL-10)在患者血清中的浓度；用免疫组化检测CD8’细胞、IFN-γ’细胞、IL-17A+细胞、IL-22+细胞或Foxp3+细胞在患者皮肤中的浸润情况；用磁珠分选的CD4+CD25+Treg细胞与自体CD8+T细胞或CD4+CD25-Tresp细胞共培养以研究Treg对自身Teff体外增殖的抑制作用。结果：VV患者外周血中Tc/CTL各效应亚群、Th17和Th22亚群百分率升高,而Treg百分率降低；进展期患者血清中Teff相关的细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17A和IL-22的浓度高于正常对照,而Treg相关的TGF-p浓度下降；进展期白斑边缘皮肤中表达CD8、IFN-γ、IL-17A或IL-22的Teff细胞以及表达Foxp3的Treg细胞数量比正常人皮肤明显增多；来自进展期VV患者外周血的Treg细胞对自体CD8’T细胞和CD4+CD25-Tresp细胞增殖及促炎症因子释放的抑制作用比正常对照明显降低。结论：VV患者中存在Teff/Treg的失衡,Treg在外周血中比例下降和功能受损不能有效抑制Teff的扩增和活化,可能参与了W及其伴发的AID和ALD的发生发展。第三部分Teff相关细胞因子对MC生物学功能的影响目的：探讨进展期VV患者中升高的Teff亚群相关细胞因子对人MC生物学功能的影响方法：分别用来自进展期VV患者PBMC刺激上清,磁珠分选的CD4+T细胞或CD8+T细胞刺激上清,加入抗IFN-γ、抗IL-17A或抗IL-22抗体的CD4+T细胞或CD8+T细胞刺激上清,以及不同浓度的细胞因子IFN-γ、IL-17A或IL-22作用于体外培养的人MC48小时,用CCK8法检测不同给药组MC的生长增殖、L-DOPA法检测酪氨酸酶(TYR)活性以及NaOH溶解法检测黑素合成量的变化；用荧光定量PCR检测IFN-γ、IL-17A或IL-22对MC的TYR、酪氨酸酶相关蛋白(TRP)-1和MITF的mRNA表达的影响。结果：患者的PBMC刺激上清,CD4+T细胞或CD8+T细胞刺激上清皆能抑制MC的生物学功能；CD4+T细胞或CD8+T细胞刺激上清中加入抗WN-γ、抗IL-17A或抗IL-22抗体后细胞功能有所恢复；不同浓度的细胞因子IFN-γ、IL-17A或IL-22对MC合成黑素的功能皆有一定的抑制作用；IFN-γ、IL.17A和IL-22皆可抑制MC的TYR和MITF mRNA的表达。结论：进展期VV患者的Teff亚群可通过分泌更高浓度的细胞因子IFN-γ、IL-17A和IL-22抑制MC合成黑素的功能,这可能是导致VV患者皮肤出现色素脱失斑的原因。第四部分IFN-γ、IL-17、IL-22诱导MC凋亡的作用目的：了解细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-22诱导体外培养的人MC发生凋亡的作用。方法：400ng/ml浓度的IFN-γ、IL-17A和IL-22分别作用于体外培养的MC48小时,用倒置显微镜观察细胞形态,Hoechst33258染液观察细胞核变化,AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测MC凋亡率结果：IFN-γ能诱导高比例的MC发生凋亡,凋亡细胞镜下表现为细胞变扁平,树突消失,胞核碎裂；Hoechst33258胞核染色呈浓染致密的颗粒块状荧光；Annexin V/PI染色显示发生早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均明显高于空白对照。而IL-17A和IL-22对MC凋亡的诱导作用与空白对照无明显差异。结论：WN-γ具有诱导MC发生凋亡的作用,这可能是导致VV患者黑素细胞丢失而出现皮肤白斑的原因。