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目的线粒体融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)是一种对多种恶性肿瘤细胞具有增殖抑制功能的新基因。我们的前期研究证实与正常乳腺细胞相比，Mfn2在乳腺癌细胞内呈低表达，转染外源性Mfn2可抑制乳腺癌细胞增殖。本课题旨在研究Mfn2蛋白的P21Ras结构域对其抑制乳腺癌细胞增殖功能的重要性及可能的机制。方法实验设置4个组，分别为Mfn2组（转染携带Mfn2基因开放阅读框序列的pEGFP-Mfn2质粒）、Mfn2-△P21Ras组（转染携带去除P21Ras结构域后的Mfn2基因开放阅读框序列的pEGFP-Mfn2-△P21Ras质粒）、N1组（转染空白质粒pEGFP-N1）和Mock组（未转染组）。1分别构建pEGFP-Mfn2和pEGFP-Mfn2-△P21Ras质粒，经测序验证后将质粒分别导入体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞中。培养48h后，用荧光显微镜观察EGFP荧光蛋白的表达，以验证转染是否成功。2转染48h后，应用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）法和免疫细胞化学法检测各组MCF-7细胞中Mfn2的mRNA和蛋白水平的变化。3转染48h后，应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定各组MCF-7细胞的增殖活性；流式细胞法分析各组细胞周期的变化情况。4转染48h后，应用FQ-PCR法和免疫细胞化学法检测各组MCF-7细胞中细胞周期蛋白Cyclin E的mRNA和蛋白水平的变化。5用Western blot法检测各组中Ras通路中的重要信号分子——磷酸化激活ERK1/2（p-ERK1/2）的蛋白水平。结果1除Mock组外，荧光显微镜下其余三组细胞内均可见EGFP的绿色荧光，证实各组质粒成功导入MCF-7细胞。2FQ-PCR和免疫细胞化学结果显示，与Mock和N1组相比，Mfn2组和Mfn2-△P21Ras组中Mfn2的mRNA及蛋白的表达水平明显增高（P<0.05）；Mfn2组和Mfn2-△P21Ras组间无差异（P>0.05）。这提示质粒携带的外源性Mfn2在MCF-7细胞内被转录和翻译。3MTT结果显示，Mfn2-△P21Ras组的细胞增殖率与Mock和N1组的相似，显著高于Mfn2组（P<0.05）；流式细胞法分析显示，Mfn2组的细胞周期多阻滞在G1/G0期，与之相比，Mfn2-△P21Ras组的G1期细胞显著减少（P<0.05），Mfn2-△P21Ras组的细胞周期分布与Mock和N1组相似（P>0.05）。这些结果显示，Mfn2-△P21Ras组的Mfn2失去了抑制MCF-7细胞增殖的能力。4FQ-PCR的结果显示，各组间CyclinE的mRNA水平无显著差异，而免疫细胞化学结果显示，Mfn2-△P21Ras组的Cyclin E蛋白水平与Mock和N1组的相似，显著高于Mfn2组（P>0.05）。这提示，Mfn2抑制细胞增殖的能力可能与其下调Cyclin E蛋白水平有关。但是去除P21Ras的Mfn2失去调控Cyclin E蛋白表达的能力。5Western blot结果显示，Mfn2-△P21Ras组的p-ERK1/2蛋白水平与Mock和N1组的相似，显著高于Mfn2组（P<0.05）。这提示Mfn2可能有调控ERK1/2蛋白磷酸化的作用，而Mfn2-△P21Ras蛋白则失去了此功能。结论1Mfn2过表达可能是通过阻止ERK1/2蛋白的磷酸化，进而下调ERK1/2蛋白的下游基因Cyclin E的蛋白表达，来使细胞周期停滞在G0/G1期，抑制乳腺癌细胞的增殖。2虽然外源性Mfn2-△P21Ras在MCF-7细胞内被转录和翻译，但Mfn2-△P21Ras蛋白不能阻止ERK1/2的磷酸化，从而不能下调Cyclin E的表达，而失去抑制乳腺癌细胞的增殖和阻滞细胞周期的功能。这些结果提示P21Ras结构域对Mfn2蛋白发挥抑癌作用至关重要。