第一部分构建双核酶自切割HCV JFH1复制子并研究其体内外复制特性背景和目的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因组长度为9.6kbp,是正链RNA病毒,其基因组由编码区、非编码区两部分构成。编码区包含:核心蛋白区、包膜蛋白区、P7蛋白区、非结构区;非编码区是由5’与3’非编码区组成。HCV是导致慢性丙型肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原体,目前已有越来越多的人受到该病毒的困扰,但迄今为止依然没有对应有效的疫苗。根据世界卫生组织的统计,目前全世界范围内共有1.8亿慢性丙型肝炎患者,HCV防治已经成为我国乃至全球的最主要公共卫生问题。目前HCV的治疗主要依靠聚乙二醇干扰素(pegylated interferon,PEG-IFN)联合利巴韦林(ribavirin,RBV),但其疗效有限,且在不同的HCV基因型间,疗效差异明显,所以目前迫切的需要研制出更有效的抗HCV药物,为临床的治疗提供帮助。但在进行新的抗HCV药物研制中,受制于缺乏合适的HCV感染模型,导致研究工作进程中困难重重。现在已有报道已经在HCV JFH1的基础上构建了多顺反子、单顺反子的HCV全长基因组、亚基因组复制子,但是这种类型的复制子虽然可以启动病毒的复制,但产生不了具有包膜的完整病毒,限制了HCV生物学特性的研究;Kato等发明了一个新的方法,通过人工体外转录的方式合成了JFH1全长RNA,利用电转染进Huh7.5细胞并启动HCV的合成,但这个方法操作过程极其复杂,而且不能用于动物实验,也不能用来建立稳定转染的细胞株,具有很大的局限性;在体内的模型研究中,已知黑猩猩对HCV敏感并可以表现出相似的肝炎病程,但是由于伦理、经济的缘故,很难将黑猩猩用作动物模型;鉴于此,构建合适的HCV全长基因组体内和体外复制模型,是更深入的进行hcv研究工作的重要基础。本研究基于jfh1cdna序列,建立了双核酶自切割hcv全基因组复制子,该复制子可在细胞内直接启动hcv复制,并包装出具有感染性的病毒颗粒,病毒进行复制、包装、释放、重新感染的过程,保持了培养系统里hcv长时间稳定和高效率的复制,模拟了hcv完整的生命周期循环,可用于hcv生物学特性研究及抗hcv药物长期的观察和筛选。并且该复制子也可进行动物模型的研究。方法1.在hcvjfh1及hcvjfh1/gnd的cdna序列两侧分别利用pcr基因重组技术加上核酶序列,分别与真核表达载体pcdna3.1进行基因重组,构建含双核酶自切割序列hcvjfh1全基因组复制子,即重组质粒pcdna3.1-rz-jfh1和其阴性突变株pcdna3.1-rz-jfh1/gnd。2.我们把构建的复制子化学转染进huh7.5细胞、通过尾静脉高压注射进行昆明小鼠的实验。观察细胞培养上清hcvrna、小鼠血清hcvrna水平;细胞免疫荧光、免疫组化学染色和相关的血清学检查分别测试该复制子的体内和体外复制的特点。主要结果1.双核酶自切割hcvjfh1全基因组复制子构建成功:重组质粒pcdna3.1-rz-jfh1及pcdna3.1-rz-jfh1/gnd,经ecori、xbai酶切鉴定,酶切条带大小均与预期一致,重组质粒构建成功。2.在16周的检测期内,从转染pcdna3.1-rz-jfh1复制子的huh7.5培养液中长时间平稳的检测出hcvrna,其拷贝数可达到1×106~3×106/ml。pcdna3.1-rz-jfh1/gnd细胞培养上清中的hcvrna水平一直低于检测下限。3.复制子pcdna3.1-rz-jfh1转染组细胞中出现hcv核心抗原染色阳性细胞约占20%;hcv感染组细胞中出现hcv核心抗原染色阳性的细胞约占5%。复制系统里包装出的的病毒颗粒有感染性,可以感染新的huh7.5细胞。4.短期的病毒血症在尾静脉高压注射了hcvjfh1复制子的昆明小鼠中被检出,随后进行的其肝脏免疫组化染色中,hcv抗原阳性细胞未被观察到,同时小鼠血清中也未能检测到hcv抗体。结论本研究建立的hcvjfh1全长复制子可以在体外培养系统内长时间、平稳、高效地包装出具有感染性的hcv病毒颗粒,但在体内实验中,未能取得理想效果;可能是hcvjfh1病毒株来源的特殊性导致了这种结果。本实验构建的hcvjfh1全长基因组复制子了,在hcv生物学特性研究和抗hcv药物测试等方面可以起到很大的作用。第二部分聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗hcv6型感染者的临床疗效回顾性分析背景与目的研究发现,聚乙二醇干扰素(pegylatedinterferon,peg-ifn)联合利巴韦林(ribavirin,rbv)治疗hcv,已经成为临床医生的共识,但是疗效上却取决于hcv感染的基因型,不同的基因型所取得的持续性病毒学应答(sustainedvirologicalresponse,svr)率有明显差异,有研究提示hcv1型最低,只有40-50%左右,hcv2/3型可达到70-80%,甚至可以更高。hcv共有6个基因型,其中1型、2型和3型呈全世界分布,而4型、5型主要分布在非洲,6型主要流行于亚洲。由于世界经济及医疗卫生的格局,hcv4型、5型、6型的研究甚少,主要的研究集中在hcv1型、2/3型。近年来,我国医疗卫生条件的改善,hcv的传播方式发生了改变,输血和使用血液制品导致的hcv感染已经明显下降,随之而来的是静脉吸毒导致的hcv感染比例明显提高。由于静脉吸毒史是导致hcv6型感染的主要原因,所以我们国家的hcv6型感染者比例呈上升趋势,有研究表明,这种趋势尤其以我国西南地区为甚,这可能与我国西南地区毗邻东南亚全球毒品主要生产地之一的缘故。hcv6型感染者的比例不断升高,对我们的临床治疗提出了规范化要求。目前hcv1型和2/3型感染者临床上均有标准的治疗方案,但hcv6型感染者的治疗方式及疗程还需进一步探讨、商榷并确定。曾经有报道分析hcv1型、2/3型、6型病例的peg-ifn联合rbv抗病毒治疗效果,研究发现,hcv1型治疗效果最差,而hcv6型病例治疗效果明显好于hcv1型,但是和hcv2/3型病例的抗病毒疗效无明显差异。另外有研究将hcv6型分别应用了24w和48w的peg-ifn联合rbv的病例入组,比较两者在治疗时间上抗病毒效果的差异,最后发现两者的疗效没有统计学的差异。由于目前有大量的报道都认为hcv6型病例应用peg-ifn联合rbv治疗24w取得的效果可以达到hcv2/3型同样治疗方案的水平。本研究在重庆第三军医大学西南医院感染科的所有门诊和住院的病人中,收集了2010年5月-2014年10月应用peg-ifn联合rbv治疗的hcv6型、2/3型感染者的详细病例资料进行回顾性分析,经过严格的入组筛选过程,我们最终入组了137例病人。hcv6型患者53例,hcv2/3型患者84例。通过比较基线资料,各个时间点的病毒应答情况来比较两组间疗效的差别,用来对临床工作作出指导。方法收集重庆西南医院感染病专科医院2010年5月至2014年10月所有门诊和住院期间应用peg-ifn联合rbv治疗的hcv6型感染者和2/3型感染者的临床资料(年龄、性别、hcvrna水平、alt水平、腹部彩超结果、感染途径、治疗过程),进行病例入组,所有纳入病例符合以下纳入条件:(1)利巴韦林每日用量针对体重<65kg、65-85kg、>85kg的病人分别为800mg、1000mg、1200mg;派罗欣皮下注射180μg/周;佩乐能每周皮下注射1.5μg/kg;(2)治疗时间大于等于24周,小于等于26周。并且有6个月以上随访完整资料;(3)排除hbv、hiv、糖尿病、高血压、自身免疫性肝病等疾病。将患者分为hcv6型与2/3型感染者两组,分别对两组患者的rvr、evr、svr进行比较。采用spss18.0软件进行分析,计量资料以平均值±标准差(x±s)的方式标出。t检验被应用到对基线计量资料的比较中;率的比较采用χ2检验;对感染者基线资料与最终抗病毒疗效的影响,采用多因素logistic回归分析;对疗效评价采用非劣效检验,即当试验组非劣于对照组时,认为试验成功。经临床专家商讨,非劣效性界值△=15%,p<0.05作为统计学检验水准。主要结果1.hcv6型与2/3型感染者年龄及性别分布、治疗前血清hcvrna与alt水平以及应用peg-ifn种类均无统计学差异。但吸毒史在hcv6型感染者中的比例高于hcv2/3型感染者所占的比例(p=0.001)。2.hcv6型、2/3型感染者获得rvr比例分别是88.7%、89.3%,率差95%可信区间为:(-0.1139,0.1019);获得evr的比例分别是94.3%、96.4%,率差95%可信区间为:(-0.0950,0.0530);获得svr的比例分别是86.8%、90.5%,率差95%可信区间为:(-0.1476,0.0736);hcv6型、2/3型感染者rvr对svr的阳性预测值分别为89.4%、93.3%,率差95%可信区间为:(-0.1436,0.0656);EVR对SVR的阳性预测值分别为88.0%、91.4%,率差95%可信区间为:(-0.1428,0.0748)。上述指标的率差95%可信区间下限均小于非劣效性界值0.15,非劣效性检验成立,可以认为在上述各项指标的比较中,HCV 6型感染者非劣于HCV 2/3型感染者。3.有无吸毒史对HCV 6型感染者各个识相点的治疗应答影响均无统计学差异。结论采用聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗HCV 6型感染者的疗效非劣于HCV2/3型感染者,故我们可以把24周的标准PEG-IFN联合RBV疗法作为临床上HCV6型的标准治疗方案。