长白山林蛙皮胶原蛋白肽的制备及其活性研究

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本文以长白山林蛙皮为实验材料,采用生物工程高新技术和膜分离纯化手段,运用数学建模优化酶解工艺条件,制备出林蛙皮胶原蛋白肽(LWT),并对其基本理化性质和生物活性进行了研究,其结果如下:1.通过不同蛋白酶酶解效果比较,确定单一碱性蛋白酶进行酶解实验。2.运用数理统计和数据拟合分析方法对LWT酶解过程中的加酶量、酶解温度、酶解时间、pH、料液比五因素进行优化,并建立了LWT酶解过程中相关数据与水解度关系的数学模型。3.数学模型预测得出LWT的最佳酶解条件为:加酶量0.55%-0.58%,酶解时间3.0h,酶解温度50℃,pH9.0,料液比1:3。经实验验证,这一方案是水解度的最佳值(峰值)。4.采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定LWT的分子量,电泳结果表明其分子量在3.5kD以下;高效液相色谱图谱表明LWT中不同分子量肽段较为集中,且分子量差别不大。5.研究LWT的理化性质,得出水分含量为5.17%,无机盐含量为2.81%,总氮含量为15.13μg/mL,总蛋白质含量为94.5μg/mL,钙含量为0.02%,特异氨基酸羟脯氨酸含量为34.70μg/mL。6.柱前衍生RP-HPLC法测定LWT中氨基酸含量,结果显示LWT中主要含有以下18种氨基酸:谷氨酸,甘氨酸,赖氨酸,亮氨酸,丙氨酸,天冬氨酸,精氨酸,羟脯氨酸,丝氨酸,脯氨酸,异亮氨酸,苏氨酸,苯丙氨酸,酪氨酸,缬氨酸,组氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸,并得出其含量。7.分别采用紫外光谱、红外光谱、飞行时间质谱、扫描电子显微电镜等分析方法对LWT进行进一步研究,结果表明,该LWT与市场上所售高纯度鱼胶原蛋白肽的吸收波长和官能团均一致,飞行时间质谱仪检测LWT分子量范围主要集中在1500Da-3000Da之间,与聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相吻合,扫描电子显微电镜扫描图谱显示LWT呈微小球状体,球体表面均匀,中间有空隙,并通过能谱仪测定出LWT样品中的元素种类和含量。8.在33%相对湿度和81%相对湿度下,分别对比分析LWT与甘油的吸湿率和保湿率数据,发现该LWT具有良好的吸湿保湿性。9.通过对LWT功能特性的研究,证明LWT具有明显的还原能力和清除超氧阴离子自由基能力。10.通过小鼠实验来研究LWT对溴代苯小鼠肝损伤的保护作用和抗氧化作用,结果表明LWT具有显著降低小鼠肝组织中丙二醛(MDA)含量和显著提高小鼠肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力的作用,具有抗氧化作用。
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