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目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种在世界范围内发病率和死亡率都非常高的恶性肿瘤,死亡率仅次于胃癌和食管癌,由于进展快、转移、复发率高使其患者治疗后5年生存率不足5%。流行病学和分子生物学实验均表明原发性肝癌与嗜肝病毒的感染有着密切的联系,以乙型肝炎病毒(HBV)为主。研究表明,肝癌发生与发展的过程涉及多基因表达及活性的改变,其中包括微小RNA(micro RNA,miRNA)分子。微小RNA是一种内源性、非编码的小RNA分子,长度一般约22个核苷酸,在转录水平和转录后水平调控许多基因的表达,参与正常的生长过程、分化过程、发育过程以及疾病的发生发展,包括肿瘤。目前已经发现在HBV相关的肝癌中,许多miRNAs异常表达,其具体分子机制尚未充分阐明。本实验室的前期工作中,Solexa测序发现一个在HBV阳性的肝癌组织中异常高表达的miRNA—novel-miR-12,进一步研究发现它在HBV阳性的肝癌细胞,和HBV感染的肝癌病人血清中都是高表达的,通过上调吞噬和细胞移动蛋白1(ELMO1)促进肝癌细胞活性和迁移侵袭能力。本课题拟在此基础上,研究novel-miR-12对肝癌细胞其它恶性行为和HBV自身基因表达的影响,并确定novel-miR-12新的作用靶基因,同时检测该靶基因对肝癌细胞恶性行为和HBV自身基因表达的影响,从而阐明novel-miR-12在HBV感染相关的肝癌发生发展的可能分子机制及其可能的调控途径。方法先,为了更好地研究novel-miR-12在肝癌细胞Hep G2中的作用,我们筛选了稳定表达novel-miR-12的多克隆细胞株。通过平板克隆形成实验、转化实验、FACS研究novel-miR-12对肝癌细胞生长增殖、转化和细胞周期的影响。通过生物信息学的方法预测了其靶基因,随后,筛选了一个与肿瘤生长与转化能力密切相关的靶基因骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制子(BMP and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI)作为研究对象。我们利用荧光报告载体实验、q RT-PCR和western blot实验证实BAMBI是否是novel-miR-12的直接作用靶基因。然后,通过过表达BAMBI及RNA干扰技术敲降BAMBI,用平板克隆形成实验、转化实验、FACS研究了靶基因BAMBI对肝癌细胞恶性行为的影响和机制。为了研究novel-miR-12对HBV抗原表达的影响,我们在Huh7细胞中,共转novel-miR-12和HBV-1.3copy,在Hep G2.2.15细胞中封闭novel-miR-12,利用ELISA方法检测novel-miR-12对HBV抗原表达的影响。最后,我们构建了HBV的五个启动子,通过双荧光素酶报告系统确定novel-miR-12对启动子的影响。结果实验室的前期结果表明在HBV相关的肝细胞癌中,novel-miR-12是异常高表达的。在此基础上,我们利用功能学实验证实novel-miR-12促进肝癌细胞的集落形成能力、加速细胞周期的进程、促进永生化正常肝细胞的转化能力。生物信息学分析发现BAMBI是novel-miR-12的候选靶基因,荧光报告载体实验、q RT-PCR和western blot实验表明BAMBI是novel-miR-12的直接作用靶基因,novel-miR-12上调其表达。过表达BAMBI,促进肝癌细胞的集落形成能力,加速细胞周期进程,促进了细胞的转化能力;相反,敲降BAMBI,抑制肝癌细胞的集落形成能力,减慢细胞周期进程,抑制了细胞的转化能力。ELISA结果显示novel-miR-12抑制HBV的HBs Ag和HBe Ag的表达。最后,共同转染novel-miR-12和不同的HBV启动子,双荧光素酶报告系统结果显示,novel-miR-12抑制HBV的Enhancer I/Xp启动子的活性。结论首次发现novel-miR-12促进肝癌细胞的集落形成能力,加速细胞周期进程,使永生化正常肝细胞产生恶性行为。Novel-miR-12通过直接靶定并上调BAMBI的表达促进肝癌细胞的恶性行为。Novel-miR-12通过抑制HBV的Enhancer I/Xp启动子的活性抑制HBs Ag和HBe Ag的表达。综上所述,在肝癌细胞中novel-miR-12靶定并上调BAMBI的表达促进肝癌细胞的恶性行为,发挥促癌基因的作用,从而促进肝癌的恶性进展,同时发现novel-miR-12抑制HBV抗原的表达。