论文部分内容阅读
冬凌草甲素(Oridonin),是从唇形科(Labtea)香茶菜属(Rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类(Ent-kaurene diterpenoid)天然有机化合物。研究发现冬凌草甲素能显著抑制肿瘤细胞的活性,对人肝癌、乳腺癌、胆囊癌等细胞均有显著的抑制增殖作用,并且有较低的毒性,对人体的重要脏器没有明显的损伤。本课题组前期研究发现冬凌草甲素可能阻滞人胃癌SGC-7901细胞于M期,本论文是在此基础上对这一实验结论进行进一步验证。首先对冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞增殖作用进行考察,其次对其诱导肿瘤细胞发生周期阻滞的机制进行研究,最后对细胞周期的特异性周期阻滞机理进行研究。本实验主要有三大内容,分别为1)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响,其中包含五个内容,(1)MTT法测定冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞生长曲线的影响,(2)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞平板克隆形成能力的影响,(3)倒置显微镜观察冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞形态的影响,(4)PI单染测定冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞阳性染色细胞率的影响,(5)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞浆中caspase-8、caspase-9、caspase-3和PARP活性的影响;2)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞周期阻滞的影响,其中包含两个内容,(1)流式细胞术检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞周期阻滞的影响,(2)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞CDK4和cyclinD1蛋白表达的影响,(3)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞CDK2和cyclinA蛋白表达的影响;3)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞M期阻滞的影响,其中包含三个内容,荧光显微镜法和Western Blotting法检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞中磷酸化Ser10组蛋白H3表达的影响,Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901 细胞 G2/M 期转换因子 cyclinB1 和 CDK1(cdc2)表达的影响。实验研究结果表明,1)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响,(1)MTT法检测不同浓度的冬凌草甲素16、32、64、128、256 μM能抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖,并随着作用时间的延长和药物浓度的增加,抑制作用明显增强,呈时间-剂量依赖性,(2)平板克隆实验检测不同冬凌草甲素作用于人胃癌SGC-7901细胞24 h后,实验发现冬凌草甲素可明显抑制人胃癌SGC-7901细胞克隆形成,分别以终浓度为2、4、8 μM的冬凌草甲素作用于人胃癌SGC-7901细胞后,与阴性对照组相比,细胞形成克隆的数量明显减少并且形成单个克隆的直径更小,(3)倒置显微镜下观察可见,阴性对照组细胞密度大,细胞形态呈多边形,边缘清晰,培养液中几乎没有悬浮的细胞。随着冬凌草甲素浓度的增加,细胞大量悬浮在培养液中,细胞胞体缩小,胞质浓缩,有少数细胞体积增大,细胞破裂,呈细胞坏死状,(4)流式细胞仪检测不同浓度的冬凌草甲素作用于人胃癌SGC-7901细胞48 h后的PI染色阳性率,检测结果显示,分别以终浓度为30、40、50 μM的冬凌草甲素作用于人胃癌SGC-7901细胞后,与阴性对照组(4.03±2.77)%相比,其PI染色阳性率逐渐上升,分别为(7.63±4.29)%、(36.57±2.77)%、(43.20±8.27)%,与阴性对照组相比具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),(5)Western blotting 分析冬凌草甲素对 caspase-8、caspase-9、caspase-3 和PARP表达的影响结果表明,冬凌草甲素可上调cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达,各剂量组与阴性对照组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01),以上结果表明冬凌草甲素能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并产生凋亡;2)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞周期阻滞的影响,(1)PI单染,流式细胞术检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞的周期影响,分别加入终浓度为8、16、32μM的冬凌草甲素,给药48 h后与阴性对照组(10.18±0.69)%比较,G2/M期比例明显升高,百分比分别为(11.64±0.33)%、(25.60±0.47)%、(37.36±1.73)%,与阴性对照组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01),(2)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞CDK4和cyclinD1蛋白表达的影响结果显示,随着冬凌草甲素浓度的增加,可以上调CDK4和cyclinD1的表达,促使处在G0/G1期的细胞逐渐向S期细胞转变,(3)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞CDK2和cyclinA蛋白表达的影响结果显示,随着冬凌草甲素浓度的增加,可以上调CDK2和cyclinA的表达,促使处在S期的细胞逐渐向G2期转变,3)冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901 细胞 M 期阻滞的影响,(1)荧光显微镜观察冬凌草甲素对人胃癌 SGC-7901 细胞中磷酸化Ser10组蛋白H3表达的影响,经荧光染色后,被PI染色的细胞呈红色,被Alexa Flour 488染色的细胞呈绿色,红色细胞代表细胞的总数量,绿色细胞代表M期(p-H3阳性)细胞的数量,随着冬凌草甲素浓度的增加,绿色细胞的数量逐渐增加,本研究结果表明冬凌草甲素可将人胃癌SGC-7901细胞阻滞在M期而不是G2期,从而抑制细胞的增殖。(2)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞cyclinB1和CDK1(cdc2)表达的影响结果显示,随着冬凌草甲素浓度的增加,可以上调cyclinB1和CDK1(cdc2)的蛋白表达,提示冬凌草甲素可促进人胃癌SGC-7901细胞由G2期向M期过渡。(3)Western Blotting检测冬凌草甲素对人胃癌SGC-7901细胞胞浆中磷酸化Ser10组蛋白H3表达的影响结果显示,随着冬凌草甲素浓度的增加作用48h后,p-H3的表达升高,与阴性对照组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01),进一步验证冬凌草甲素将人胃癌SGC-7901细胞阻滞在M期而不是G2期。通过以上实验结果表明冬凌草甲素通过将人胃癌SGC-7901细胞阻滞在M期而不是G2期来抑制其增殖。