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目的:红色毛癣菌(trichophyton rubrum)是一种最常见的亲人性致病性皮肤癣菌,主要侵犯人的皮肤,指(趾)甲,偶可侵犯人的毛发。国内外多个研究均显示在浅部真菌病患者病原菌分析中,红色毛癣菌的分离率占到首位。此外,国内金学洙等人吉林15年菌种分析研究显示在头癣致病菌中,红色毛癣菌的分离率随年代逐渐增高,到90年代后期,由80年代后期的10.6%明显增高至76.9%。红色毛癣菌不仅引起皮肤感染,最近报道也引起深部组织感染如脓癣、肉芽肿等,其发病率也在逐年升高。由于该菌所致真菌病病程持久,且难治愈,易复发,成为临床亟待研究问题之一。临床上对于红色毛癣菌引起的足癣治疗,推荐采用“1+1联合治疗”方案,即一种外用抗真菌药物加一种口服抗真菌药物联合治疗,可以缩短疗程、提高疗效及患者依从性、降低复发率。目前临床上应用的抗真菌药物对红色毛癣菌病有较好的疗效,但这些药物大都价格昂贵,毒副作用较大,且随着这些抗真菌药物的广泛应用,耐药菌株不断出现,为临床治疗带来困难。为减少药物不良反应,减少耐药菌株出现,临床常采用联合用药。亚硝酸钠是一种常用的食品添加剂,世界食品卫生科学委员会1992年发布的人体安全摄入亚硝酸钠的标准为0~0.1mg/kg体重,按此标准使用和食用,对人体不会造成危害。亚硝酸钠来源丰富,成本低廉,国外已有研究证实亚硝酸钠在酸性条件下对多种酵母菌及皮肤癣菌有较强的杀伤作用,并且临床上应用其外用制剂治疗足癣及甲真菌病有效。我科研究人员既往曾应用MTT法测定亚硝酸钠对红色毛癣菌抗菌活性的影响,结果显示在沙氏液基中亚硝酸钠对红色毛癣菌具有抑制作用;在1.25mmol/L ~160mmol/L浓度范围内,亚硝酸钠纯品对红色毛癣菌无细胞毒作用,其中在1.25mmol/L~10mmol/L浓度范围内,随着作用浓度的增加,抑制作用逐渐增强;而在10mmol/L~160mmol/L浓度范围内对红色毛癣菌抑制作用差异无显著性。电镜观察结果显示,亚硝酸钠影响菌丝超微结构,表现为菌丝的形态学改变以及红色毛癣菌细胞膜和细胞壁的破坏,并在一定浓度范围内随亚硝酸钠药物浓度的增加及作用时间的延长,对菌丝破坏程度增强,呈现剂量和时间依赖性。但目前尚未见亚硝酸钠联合其他临床常用抗真菌药物对红色毛癣菌体外联合抗菌作用的报道。在过去的几年里,对于皮肤癣菌的体外药敏试验方法及结果判读标准尚无统一界定,直至2008年,美国国家临床和实验室标准化研究所(CLSI)提出了产孢丝状真菌微量液基稀释法抗真菌药敏试验方案(M38-A方案)的第二次改良方案(M38-A2方案),其中增加了皮肤癣菌的相关内容。本试验参照该方案及其他相关文献,采用微量稀释法应用亚硝酸钠联合伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑及卡泊芬净五种抗真菌药物对临床分离的30株红色毛癣菌进行体外药敏试验,以探讨其体外联合用药的抗菌活性及最佳联合浓度,从而指导临床合理使用抗真菌药,有效预防和治疗红色毛癣菌引起的真菌感染性疾病提供依据。方法:1菌株分离、培养及鉴定30株红色毛癣菌均分离自河北医科大学第二医院皮肤科门诊的股癣及甲真菌病患者。自病变部位取材镜检并培养,根据显微镜下特征及沙氏和马铃薯培养基菌落特征等鉴定为红色毛癣菌。2体外药敏试验2.1抗真菌药物单独药敏试验用移液器分别取抗真菌药物倍比稀释液100uL,依次加入96孔板的每行第1~10孔中,第11、12孔为空白及阳性对照,分别加入200uL及100uL RPMI1640液体培养基。将菌悬液用RPMI1640液体培养基稀释50倍,得到二倍终浓度菌悬液,再依次将100uL菌悬液加入96孔板的第1~10列及第12列。30℃恒温培养4~7天,阳性对照100%生长后判读结果。2.2亚硝酸钠交叉联合抗真菌药物药敏试验用微量移液器将药物加入96孔板内,其中每行的第1~10孔,依次加入亚硝酸钠倍比稀释液50uL,浓度从高到低;每列第1~8孔依次加入抗真菌药物倍比稀释液50uL,浓度从高到低,余操作同单独药敏试验。30℃恒温培养5~7天,阳性对照100%生长后判读结果。3统计学方法:应用SPSS16.0软件对数据进行统计学处理。单独应用抗真菌药物MIC值之间比较采用多独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,进一步两两比较采用秩转换后单因素方差分析;各抗真菌药物联合亚硝酸钠前后MIC值的比较采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验;亚硝酸钠和抗真菌药物联合抗菌FIC值之间以及各抗真菌药物不同浓度之间FIC值比较采用多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,进一步两两比较采用Nemenyi法检验,P<0.05有统计学意义。结果:1临床分离菌株敏感性分布情况:伊曲康唑耐药菌株共5株;剂量依赖敏感菌株共20株;敏感菌株共5株。30株菌对特比奈芬均为敏感菌株。氟康唑耐药菌株共1株;剂量依赖敏感菌株共3株;敏感菌株共26株。未发现同时对两种或两种以上药物耐药菌株。2单独应用亚硝酸钠和抗真菌药物MIC值结果:亚硝酸钠、伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑、卡泊芬净最低抑菌浓度MIC几何均数分别为40mmol/L、0.3299ug/mL、0.0155ug/mL、4.8121ug/mL、0.0640ug/mL、1.5157ug/mL。各药间采用多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2=160.138,P<0.01,有统计学意义。两两比较经秩转换后单因素方差分析,任两组之间比较差异均有统计学意义,P<0.05。(table 1)3抗真菌药物联合亚硝酸钠后MIC值结果:伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑、卡泊芬净分别与亚硝酸钠联合之后MIC几何均数分别为0.1403ug/mL、0.0214ug/mL、5.7890ug/mL、0.0532ug/mL、0.5236ug/mL。与联合之前相比,经配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验,伊曲康唑、卡泊芬净MIC值降低,差异有统计学意义,P<0.05;特比奈芬、氟康唑MIC值升高,差异无统计学意义,P>0.05;伏立康唑MIC值降低,差异无统计学意义,P>0.05。(table 1)4亚硝酸钠和五种抗真菌药交叉联合抗菌FIC结果:4.1亚硝酸钠联合不同浓度伊曲康唑抗菌FIC结果:亚硝酸钠各浓度分别与2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0313ug/mL、0.0156ug/mL伊曲康唑交叉联合所得FIC<1所占比例分别为:3.3%(1/30)、3.3%(1/30)、16.7%(5/30)、20%(6/30)、50%(15/30)、30%(9/30)、10%(3/30)、13.3%(4/30);1≤FIC<2所占比例分别为:0%(0/30)、13.3%(4/30)、16.7%(5/30)、53.3%(16/30)、23.3%(7/30)、33.3%(10/30)、50%(15/30)、46.7%(14/30);FIC≥2所占比例分别为:96.7%(29/30)、83.3%(25/30)、66.7%(20/30)、26.7%(8/30)、26.7%(8/30)、36.7%(11/30)、40%(12/30)、40%(12/30)。经多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2=33.827,P<0.001,差异有统计学意义。进一步各浓度之间分别两两比较,伊曲康唑0.125ug/mL组分别与0.25ug/mL组、0.0625ug/mL组比较,差异均无统计学意义,P>0.05;与其余各组相比,均有统计学意义,P<0.05。(Fig.1, table 2)4.2亚硝酸钠联合不同浓度特比奈芬抗菌FIC结果:亚硝酸钠各浓度分别与0.04ug/mL、0.02ug/mL、0.01ug/mL、0.005ug/mL、0.0025ug/mL、0.0013ug/mL、0.0006ug/mL特比奈芬交叉联合所得FIC<1所占比例分别为:0%(0/30)、3.3%(1/30)、10%(3/30)、20%(6/30)、13.3%(4/30)、13.3%(4/30)、13.3%(4/30);1≤FIC<2所占比例分别为: 3.3%(1/30)、36.7%(11/30)、36.7%(11/30)、36.7%(11/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30);FIC≥2所占比例分别为:96.7%(29/30)、60%(18/30)、53.3%(16/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30)。经多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2=4.299,P>0.05,差异无统计学意义。(Fig.2, table 3)4.3亚硝酸钠联合不同浓度氟康唑抗菌FIC结果:亚硝酸钠各浓度分别与16ug/mL、8ug/mL、4 ug/mL、2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL氟康唑交叉联合所得FIC<1所占比例分别为:3.3%(1/30)、10%(3/30)、10%(3/30)、10%(3/30)、10%(3/30)、10%(3/30)、13.3%(4/30)、13.3%(4/30);1≤FIC<2所占比例分别为:10%(3/30)、26.7%(8/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30)、36.7%(11/30)、40%(12/30)、36.7%(11/30)、36.7%(11/30);FIC≥2所占比例分别为:86.7%(26/30)、63.3%(19/30)、46.7%(14/30)、46.7%(14/30)、53.3%(16/30)、50%(15/30)、50%(15/30)、50%(15/30)。经多独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2=14.234,P<0.05,各浓度间差异有统计学意义。进一步两两比较,16ug/mL浓度组与其他组差异均有统计学意义,P<0.05;其余任两组之间差异均无统计学意义,P>0.05。(Fig.3, table 4)4.4亚硝酸钠联合不同浓度伏立康唑抗菌FIC结果:亚硝酸钠各浓度分别与0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL、0.0625ug/mL、0.0313ug/mL、0.0156 ug/mL、0.0078 ug/mL、0.0039ug/mL伏立康唑交叉联合所得FIC<1所占比例分别为:0%(0/30)、3.3%(1/30)、3.3%(1/30)、16.7%(5/30)、26.7%(8/30)、23.3%(7/30)、3.3%(1/30)、3.3%(1/30) ; 1≤FIC<2所占比例分别为: 3.3%(1/30)、6.7%(2/30)、23.3%(7/30)、33.3%(10/30)、43.3%(13/30)、33.3%(10/30)、43.3%(13/30)、43.3%(13/30);FIC≥2所占比例分别为:96.7%(29/30)、90%(27/30)、73.3%(22/30)、50%(15/30)、30%(9/30)、43.3%(13/30)、53.3%(16/30)、53.3%(16/30)。经多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2=30.760,P<0.001,差异有统计学意义。进一步两两比较,0.0313ug/mL组除与0.0625ug/mL、0.0156ug/mL组差异无统计学意义之外,与其余各组比较均有统计学意义,P<0.05。(Fig.4, table5)4.5亚硝酸钠联合不同浓度卡泊芬净抗菌FIC结果:亚硝酸钠各浓度分别与8ug/mL、4ug/mL、2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL、0.25ug/mL、0.125ug/mL卡泊芬净交叉联合所得FIC<1所占比例分别为:10%(3/30)、20%(6/30)、26.7%(8/30)、30%(9/30)、73.3%(22/30)、30%(9/30)、6.7%(2/30);1≤FIC<2所占比例分别为:10%(3/30)、6.7%(2/30)、3.3%(1/30)、50%(15/30)、10%(3/30)、33.3%(10/30)、46.7%(14/30);FIC≥2所占比例分别为:80%(24/30)、73.3%(22/30)、70%(21/30)、20%(6/30)、16.7%(5/30)、36.7%(11/30)、46.7%(14/30)。经多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2=51.176,P<0.001,差异有统计学意义。进一步两两比较,0.5ug/mL组与其他各浓度组比较均有统计学意义,P<0.05。(Fig.5, table6)4.6五种抗真菌药物分别联合亚硝酸钠后的抗菌作用FIC之间比较结果:亚硝酸钠分别与伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑、卡泊芬净交叉联合后所得FIC<1所占比例分别为:63.3%(19/30)、6.7%(2/30)、20%(6/30)、50%(15/30)、70%(21/30) ; 1≤FIC<2所占比例分别为:26.7%(8/30)、36.7%(11/30)、33.3%(10/30)、20%(6/30)、13.3%(4/30);FIC≥2所占比例分别为:10%(3/30)、56.7%(17/30)、46.7%(14/30)、30%(9/30)、16.7%(5/30)。不同药物之间经多个独立样本比较的Kruskal-wallis H检验,χ2值=36.630,P<0.01,差异有统计学意义。进一步分别进行两两比较,伊曲康唑与特比萘芬、氟康唑之间比较差异有统计学意义,P<0.01;伏立康唑与特比萘芬、氟康唑之间比较差异有统计学意义,P<0.01;卡泊芬净与特比萘芬、氟康唑之间比较差异有统计学意义,P<0.01;伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬净三者之间任两组比较,差异均无统计学意义,P>0.05;特比萘芬与氟康唑之间差异无统计学意义,P>0.05。结论:本试验参照美国国家临床和实验室标准化研究所(CLSI)提出的(M38-A2)方案,采用微量稀释法进行亚硝酸钠、伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、伏立康唑及卡泊芬净单独及联合应用对临床分离的30株红色毛癣菌进行体外抗菌活性研究,得出以下结论:1亚硝酸钠在1640液体培养基中对临床分离的红色毛癣菌MIC值较高,高浓度有一定体外抗菌活性。2亚硝酸钠与伊曲康唑、卡泊芬净体外联合MIC值降低,协同作用较强。3亚硝酸钠与0.125ug/mL浓度伊曲康唑联合协同作用最好。4亚硝酸钠与0.5ug/mL浓度卡泊芬净联合协同作用最好。5亚硝酸钠与特比萘芬、氟康唑体外联合MIC值升高,以拮抗作用为主。