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目的:1.研究过表达的mi R-223对K562细胞中融合基因BCR-ABL的作用。2.研究mi R-223慢病毒转染K562后对其增殖的影响。方法:1.mi R-223慢病毒载体的制备:通过PCR扩增获得目的基因hsa-mi R-223全长c DNA片段,纯化后经Age I和Eco RI酶切消化。同时用Age I酶Eco RI酶对载体质粒进行酶切、回收得到线性化载体片段。T4噬菌体DNA连接酶作用将hsa-mi R-223连接至线性化载体,连接产物经转化、涂板、挑取克隆、扩增培养后,用质粒小量抽提试剂盒提取质粒,酶切后PCR凝胶电泳鉴定连接产物,并行序列测定。将构建好的mi R-223基因表达载体进行病毒颗粒包装,得到hsa-mi R-223过表达慢病毒重组质粒载体系统GV309-mi R-223-EGFP和GV-309-EGFP空载组,采用PCR对重组载体进行鉴定。2.采用CCK-8比色、RT-PCR、Western blotting等方法,研究上调mi R-223对K562细胞生物学特性的影响。3.RT-PCR检测K562细胞中融合基因BCR-ABL的表达情况。4.Western blotting检测K562细胞中融合蛋白BCR-ABL和Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达。结果:1.mi R-223过表达慢病毒重组质粒载体系统测序鉴定结果与目标序列完全一致,包装后的慢病毒经RT-PCR测定滴度约为3×108TU/ml。2.mi R-223重组慢病毒质粒感染K562细胞48h后,观察到GFP(绿色荧光蛋白)稳定表达。RT-PCR显示GV309-mi R-223-EGFP组细胞mi R-223在m RNA水平表达增加,与对照组相比,增加1463倍。CCK-8比色实验显示,与对照组相比,GV309-mi R-223-EGFP组的K562细胞生长较明显受抑制(P<0.05)。3.RT-PCR及Western blotting显示,与对照组相比,GV309-mi R-223-EGFP组K562细胞Bcl-2表达呈下降趋势,融合蛋白BCR-ABL表达下降,同时均有Caspase-9和Caspase-3的剪接激活。结论:1.mi R-223过表达可使K562白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白下调。2.mi R-223过表达可使Bcl-2表达下调,同时均可激活Caspase-9和Caspase-3的表达剪接,从而抑制K562细胞增殖。