牙槽骨可因根尖周炎症、外伤、肿瘤等导致缺损,伴随牙列缺损或缺失,严重影响口腔功能及美观,是临床常见的问题。早期功能修复如拔牙后即刻植入种植体,常因牙槽骨缺损难以实施,传统方法以骨移植解决这些问题,但自体移植骨供区有限,并会造成供区部位组织创伤,人工制备具有成骨诱导活性的合成替代材料,即组织工程技术,已成为重要的研究探索方向。组织工程采用种子细胞复合支架材料以及生物活性因子模拟天然骨成分和结构构建骨替代材料,已有大量尝试和研究,目前存在的主要问题有种子细胞的来源不足、获取困难,诱导成骨效率和临床应用安全性等方面仍有争议,本研究采用人脐带多向分化潜能间充质细胞(human umbilical cord Multipotent mesenchymal stromal cells,h UCMSCs)作为种子细胞,采用神经递质多肽P物质(Neuropeptides substance P,SP)作为成骨诱导生物活性因子,在多能干细胞体外诱导成骨分化方面作出探索,希望能够为解决以上问题提供新思路和方法。人脐带间充质细胞取自从新生儿废弃的脐带内的Wharton’s胶,可通过胶原酶消化接种或组织块直接接种培养皿等方法分离,其具有间充质细胞多向分化潜能的特性,同时有来源广泛,获取方便,取材无创,源自废弃组织,没有医学伦理学障碍等特性,并且相关实验已证实该细胞够分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等功能性组织细胞,作为骨组织工程种子细胞具有独特优势。在以往的研究中,诱导人脐带间充质细胞成骨分化采用人工配制的成骨诱导液,包含地塞米松,甘油磷酸钠和抗坏血酸,成分配制比较复杂,诱导效率不够稳定,并且有低细胞毒性,容易导致体外培养的细胞死亡。本研究采用神经递质多肽P物质(SP)诱导人脐带间充质细胞成骨分化,在生物安全性、成骨分化仿生机制等方面具有优势,SP是一种具有高度保守氨基酸序列的小分子多肽(RPKPQQFFGLM),广泛的存在于多种生物的组织中。SP在早期被发现时其主要功能是作为一种神经递质,近年来的研究表明SP还是一个组织创伤修复系统的信使分子,作为重要的生物活性因子参与干细胞动员和促进创伤修复。相对于目前常用的大分子蛋白成骨因子如BMP等,SP多肽的氨基酸序列简单,合成方便,成本较为低廉,具有更好的临床应用转化潜力。体外实验表明SP可以刺激骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)增殖分化并呈浓度依赖关系,但是SP对人脐带间充质细胞的作用尚未见到相关研究。基于课题组前期研究基础,本实验研究的目的在于:明确SP对于人脐带间充质细胞增殖、分化的诱导作用,探索SP诱导人脐带间充质细胞成骨分化的最佳条件,并使用自组装肽RAD16-I材料构建立体培养环境,实现人脐带间充质细胞的体外立体培养。初步观察自组装肽水凝胶复合自固化磷酸钙材料,模拟天然骨成分和结构,形成支架材料内部SP持续缓释诱导干细胞细胞培养微环境,初步观察复合材料的体外转化情况,为后期体外构建具有成骨活性的复合材料及其临床转化应用提供基础。实验一:h UCMSCs原代培养及鉴定目的:原代培养人脐带间充质细胞(h UCMSCs),观察其显微形态,通过多种特征性标识物对所得细胞进行鉴定,并初步比较人脐带间充质细胞(h UCMSCs)和人骨髓间充质细胞(h BMSCs)的成骨分化能力。方法:使用酶消化法获取人脐带Wharton’s胶内细胞并对细胞表面标识分子进行流式细胞鉴定;使用成骨诱导液诱导h UCMSCs、h BMSCs后检测成骨相关ALP活性,使用茜素红染色观察细胞矿化能力。结果:通过原代培养得到的人脐带Wharton’s胶来源细胞呈细长梭型或不规则多边形,紧密排列,生长状态良好,经流式细胞仪检测鉴定,干细胞表面标记物CD29,CD44,CD90,CD105表达阳性,造血谱系标记物CD34,CD45,CD106表达阴性,鉴定为人脐带间充质细胞(h UCMSCs)。购买人骨髓间充质细胞(h BMSCs)作为对照,配制成骨诱导培养液,成骨分化诱导培养h UCMSCs和h BMSCs,4w后进行茜素红染色,两种细胞均形成了明显的矿化结节,染色结果未见明显差异。成骨诱导培养h UCMSCs和h BMSCs期间分批取材,检测ALP活性,显示ALP活性持续升高,与普通培养液培养对照组差异明显,二者差异不显著。结论:使用I型胶原酶酶消法可成功从人脐带Wharton’s胶获取h UCMSCs,采用常规成骨诱导液诱导培养,比较h UCMSCs和h BMSCs分化表现,证实人脐带间充质细胞(h UCMSCs)和人骨髓间充质细胞(h BMSCs)具有类似的成骨分化能力。实验二:不同浓度SP诱导hUCMSCs成骨分化目的:确定P物质(SP)诱导人脐带间充质细胞(h UCMSCs)成骨分化的可行性及其诱导作用与浓度的关系。方法:多肽合成仪人工合成SP,溶解于干细胞培养液制备含有不同浓度SP多肽(10-6M,10-8M,10-10M)的诱导培养液,对h UCMSCs进行诱导培养,定期检测细胞ALP活性、细胞增殖、细胞成骨分化相关基因表达,并行茜素红染色,观察h UCMSCs成骨分化表现,探索SP对人脐带间充质细胞(h UCMSCs)成骨诱导的可行性及其最适诱导浓度。结果:不同浓度SP诱导培养hUCMSCs4w,茜素红染色后,均形成了明显的矿化表现,培养孔中可见明显钙结节,以10-8M SP组形成的矿化结节最多,染色最深;不同浓度SP诱导培养h UCMSCs,观察细胞ALP活性,1d-7d时ALP活性均可见明显升高,以10-8M SP组在7d时ALP活性最高,其差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度SP诱导h UCMSCs细胞增殖实验中,实验组与对照组相比细胞OD值均上升,表明不同浓度SP均能够促进细胞增殖,且10-8M SP组促进作用最强,差别具有统计学意义(P<0.05)。不同浓度SP诱导h UCMSCs 3w,检测成骨相关基因表达:各浓度实验组ALP表达与对照组相比,均有统计学差异,10-8M SP组表达最高;各浓度实验组COL表达均高于对照组,10-8M SP组有统计学差异,其余组间无统计学差异;各浓度实验组OCN表达均高于对照组,10-8M SP组表达有统计学差异,其余组间无统计学差异;各浓度实验组RUNX-2表达均高于对照组,仅10-8M SP组有统计学差异,其余组间无统计学差异。结论:SP能够促进h UCMSCs的增殖并诱导其成骨分化,不同浓度SP诱导h UCMSCs分化的表现有所不同,促进h UCMSCs增殖和成骨分化的适宜SP浓度为10-8M。实验三:自组装多肽凝胶RAD16立体培养h UCMSCs目的:探索自组装多肽凝胶RAD16立体培养h UCMSCs的可行性及适宜条件方法:溶解RAD16材料于干细胞培养液,细胞培养箱静置,待其自组装形成水凝胶结构后,置于倒置显微镜、体式显微镜及扫描电镜下观察材料的结构,接种h UCMSCs,于倒置显微镜下观察细胞生长状态,通过活/死细胞荧光染色观察细胞于自组装多肽凝胶内的生长增殖情况和细胞形态,进行细胞计数和计算活死细胞百分比。结果:扫描电镜显示RAD16材料由大量纳米级纤维组成具有三维网状的结构,纤维直径约8~10nm,长度可为数百纳米,纳米级纤维相互连接形成立体网状结构,网状孔隙为微米级。倒置显微镜10×40倍镜下观察RAD16内培养1,3,5,7d的h UCMSCs,细胞接种后早期呈团装聚集,随后逐渐伸展,细胞逐渐增多,呈长梭型或多边不规则型。活/死细胞荧光染色显示细胞普遍呈绿色染色,表明为活细胞,且细胞数量逐渐增多,细胞形态逐渐伸展,呈长梭型或者多边不规则型,仅极少量细胞红染,活细胞百分比始终处于较高的状态。结论:自组装多肽RAD16水凝胶材料具有较好的细胞相容性,具有良好的孔隙结构,人脐带间充质细胞(h UCMSCs)能够在自组装凝胶立体培养系统内稳定生长、增殖、和迁移。实验四:接种h UCMSCs的自组装多肽凝胶与加载SP的自固化磷酸钙复合培养目的:探索接种h UCMSCs的自组装多肽凝胶与加载SP的自固化磷酸钙(CPC)复合构建成骨活性材料的可行方法。方法:接种h UCMSCs于自组装多肽水凝胶RAD16材料,复合加载SP的CPC材料,培养,倒置显微观察材料转化和细胞增殖分化情况,扫描电镜观察细胞粘附与材料的结合情况,活/死细胞荧光染色,观察记录细胞形态、细胞计数和活细胞的百分比,检测不同时期成骨相关基因表达,了解复合材料的成骨效能。结果:构建的复合材料(CPC-SP-h UCMSCs-RAD16)可形成细胞粘附,细胞有成骨分化表现,ALP在第7天达到顶峰并随后保持在较高水平,CollagenⅠ在前期并没有明显表达,但从第14天开始,明显增高并在第21天达到顶峰,OCN和RUNX-2的表达随着时间逐步稳定提升,茜素红染色有矿化表现。结论:复合材料CPC-SP-h UCMSCs-RAD16能够促进细胞分化粘附,表达成骨相关的基因并形成矿化基质。