琼玉膏是首载于宋·洪遵《洪氏集验方》的经典名方,由地黄（Rehmanniae Radix）、茯苓（Poria）和人参（Ginseng Radix）按7:2:1的比例组成,具有补虚健脾之功效,适用于肺肾阴虚,脾气不足等虚证证侯。前期研究发现琼玉膏可以缓解顺铂所致肾损伤,但其肾保护作用机制和药效物质尚未阐明。国内外最新研究表明,肠道菌群及其代谢物在顺铂所致肾损伤的发生和发展过程中发挥重要作用,肠道菌群是防治顺铂肾损伤的潜在靶标。中药糖/苷类成分是潜在的益生元,可调节肠道菌群,从而改善机体疾病状态。已有研究显示琼玉膏中富含多糖和苷类成分,并且琼玉膏具有肠道菌群调节活性。因此本文提出如下假说:琼玉膏可通过调节肠道菌群及其代谢物缓解顺铂所致肾损伤。为验证该假说,本研究分别分析了琼玉膏对肠道菌群及其相关代谢物的调节作用,将肠道菌、代谢物和药效指标进行关联分析,探讨三者之间的内在联系,并采用伪无菌和粪菌移植动物模型对肠道菌群的介导机制进行验证,旨在揭示基于肠菌靶标的琼玉膏减轻顺铂所致肾损伤的作用机制。在传统中药制剂的研发和生产中,多糖常被作为杂质,通过醇沉法去除。但近年来中药多糖类成分的药效活性受到越来越多的关注,特别是作为益生元对肠道菌群的调节作用被不断证实。肠道菌群是琼玉膏缓解顺铂致肾损伤的潜在作用靶标,因此需要确认醇沉部分是否含有琼玉膏的药效物质及其药效贡献如何。本研究分离制备了琼玉膏的醇沉组分和上清组分,并分别进行了化学成分表征。从经典药效指标、肠菌调节和代谢组调节作用对醇沉组分和上清组分缓解顺铂致肾损伤的药效进行评价,并与琼玉膏原方进行对比,旨在探讨琼玉膏缓解顺铂致肾损伤的药效物质基础,为基于琼玉膏的创新药物研发中“醇沉除杂”的可行性提供参考。1琼玉膏减轻顺铂致肾损伤的肠道菌群介导机制研究 采用顺铂诱导的C57BL/6小鼠急性肾损伤模型,确证了琼玉膏减轻顺铂致肾损伤的药效。琼玉膏能缓解顺铂引起的肾小管肿胀和空泡等肾组织结构变化,调节肾功能异常,提高小鼠排尿量和相对体重。依据顺铂诱导肾损伤机制的最新研究进展,采用免疫组织化学、qPCR和Western Blot等技术,检测TNF-α、TGF-β1、PARP和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）等关键基因/蛋白表达水平,评价了琼玉膏对炎症反应、肾间质纤维化、肾小管细胞异常凋亡和组蛋白去乙酰化等途径的调节作用。结果显示琼玉膏对肾组织有多效性保护作用:能缓解顺铂引起的肾组织中炎症反应,表现为减少巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,降低促炎因子TNF-α和IL-6的表达;能缓解顺铂引起的肾间质纤维化,抑制TGF-β/Smad促纤维化信号通路的过度激活;能缓解顺铂引起的肾组织细胞凋亡过程的紊乱,表现为调节p53和PARP蛋白的异常表达;能抑制顺铂引起的肾组织中HDACs的过度表达和活化。以上药效确证结果为肠道菌-代谢物-药效关联提供了数据支持。利用16S rRNA基因测序技术分析肠道菌群多样性,发现琼玉膏能减轻顺铂引起的肠道菌群紊乱。琼玉膏能调节顺铂引起的肠道菌群Alpha多样性指数的异常,提高肾损伤小鼠肠道内微生物多样性;琼玉膏能调整由顺铂引起的菌群结构的变化,显著富集益生菌Akkermansia、Faecalibaculum 和 Bifidobacterium,以及降低 Ileibacterium的丰度;琼玉膏能调节由顺铂引起的 Allobaculum、Lactobacillus、Alloprevotella、Bacteroides 和Eubacteriumfissicatenagroup 菌属的异常增殖,以及 Lachnospiraceae NK4A136 group 和CoriobacteriaceaeUCG002菌属丰度的下降;菌群功能预测分析发现琼玉膏能调节由顺铂引起的细胞凋亡、脂多糖生物合成、视黄醇代谢、酪氨酸代谢、嘌呤代谢和亚油酸代谢等功能的异常。利用UPLC-QTOF-MS/MS对肾损伤小鼠的血清、尿液和肾组织进行非靶向代谢组分析,发现琼玉膏能调整由顺铂引起的血清、尿液和肾组织的代谢轮廓异常,显著回调顺铂引起的血清中鞘脂代谢,尿液中嘌呤代谢、生物素代谢、色氨酸代谢和酪氨酸代谢通路及其对应的代谢物 Cer（d18:1/18:0）、IDP、Biotin、Serotonin 和 Norepinephrine 丰度的异常。非靶向代谢组分析还发现,琼玉膏能显著减少由顺铂引起的尿毒素Indoxyl sulfate和p-Cresyl sulfate在体内的蓄积。利用GC-MS法靶向分析小鼠粪便中的肠菌代谢物短链脂肪酸（SCFAs）,发现琼玉膏能显著回调由顺铂引起的乙酸和丁酸含量的下降。采用Spearman相关性分析发现,琼玉膏调节的菌群与SCFAs/尿毒素显著相关,SCFAs/尿毒素与肾功能和肾损伤机制指标显著相关。由此推测琼玉膏可能通过调节肠道菌群,提高SCFAs（主要为乙酸和丁酸）水平并减少与色氨酸代谢和酪氨酸代谢相关的尿毒素（主要为Indoxyl sulfate和p-Cresyl sulfate）蓄积,以缓解顺铂所致肾损伤。通过抗生素诱导的伪无菌动物实验和粪菌移植实验证实了琼玉膏减轻顺铂肾损伤的作用由肠道菌群介导。具体表现为在伪无菌状态下,琼玉膏无法缓解顺铂引起的肾组织结构变化和肾功能异常,其减轻肾间质纤维化和提高粪便中SCFAs（乙酸和丁酸）含量的作用也受到了抑制。通过粪菌移植动物模型,发现琼玉膏调节顺铂引起的肾组织结构变化和肾功能异常的作用,抗炎、抗纤维化、抗凋亡和抑制HDACs表达和活性的作用,调节血清、尿液和肾组织代谢异常,减少尿毒素体内积累的作用,提高粪便中SCFAs（乙酸和丁酸）含量的作用,都能通过肠道菌转移给受体小鼠。随后又对琼玉膏能显著上调的乙酸和丁酸缓解顺铂致肾损伤的作用进行了验证,发现乙酸、丁酸及其混合物均能缓解顺铂引起的肾组织结构变化;乙酸及混合物能调节顺铂引起的肾功能异常和小鼠体重的下降;乙酸、丁酸及其混合物具有缓解顺铂引起的肾组织中炎症反应、间质纤维化以及抑制HDACs的过度表达和活性的作用。依据研究结果结合文献相关报道,推测琼玉膏缓解顺铂所致肾损伤的作用,可能是通过其富集Akkermansia、Faecalibaculum、Bifidobacterium 和LachnospiraceaeNK4A136group等益生菌增加SCFAs（乙酸和丁酸）的产生,从而抑制HDACs的表达和活性,同时减少尿毒素（Indoxyl sulfate和p-Cresyl sulfate）的积累,从而发挥抗炎、抗纤维化和抗凋亡的作用,最终缓解顺铂引起的急性肾损伤。2琼玉膏化学组分的制备和表征 通过醇沉法对琼玉膏中的化学组分进行了分离,分为醇沉组分和上清组分,分别占比18.9%和75.5%。利用苯酚-硫酸法测定醇沉组分总糖含量为88.2%;利用HPGPC-ELSD法和柱前衍生化HPLC-UV法,对醇沉组分中的多糖进行了分子量和单糖组成的表征,发现其中多糖的分子量分布在4.24×104～2.18×106 Da之间,主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖以1.00:4.97:50.19:60.40:3.23比例组成;利用HPLC-ELSD法对醇沉组分进行了表征,发现其中含有果糖（2.97 mg/g）和寡糖（348.72 mg/g）,其中寡糖主要有水苏糖（251.99 mg/g）、甘露三糖（81.90 mg/g）、棉籽糖（10.46mg/g）和蔗糖（4.37mg/g）。利用UPLC-QTOF-MS/MS法对上清组分进行了定性表征,共鉴定出60个成分,以环烯醚萜苷、皂苷、苯乙醇苷等小分子为主;利用UPLC-TQ-MS/MS 法对上清组分进行了定量表征,Catalpol（2672.57 μg/g）、Ro（775.45 μg/g）、Melittoside（616.88 μg/g）、Leonuride（365.23 μg/g）、Acetoside（332.63 μg/g）、Echinacoside（225.77μg/g）和20S-Rg3（219.02μg/g）为其中的主要成分。以上表征结果确保了后续物质基础研究结果的可靠性和可重复性。3琼玉膏减轻顺铂肾损伤的药效物质研究 利用顺铂诱导的C57BL/6小鼠急性肾损伤模型,发现琼玉膏醇沉组分和上清组分都能缓解顺铂引起的急性肾损伤,但整体药效均不及琼玉膏。醇沉组分和上清组分对肾损伤药效指标、肠道菌群和代谢组的调节具有各自的特点。各组分均有改善由顺铂引起的肾组织结构变化和提高肾功能的作用,但两组分合用（琼玉膏）对肾组织结构变化和肾功能异常的调节效果更佳。各组分均可缓解肾组织中的纤维化和炎症,但上清组分对炎症反应的调控效果更佳。各组分均具有缓解肾组织中HDACs的基因过度表达和活性的作用,但醇沉组分的调节效果更佳。醇沉组分改善小鼠整体状态和提高粪便中微生物多样性的作用与琼玉膏相同,而上清组分效果不佳,表明醇沉组分对琼玉膏提高小鼠整体状态和肠道菌群多样性的作用有主要贡献。醇沉组分对顺铂引起的丰度异常下降的OTU有显著调节作用,上清组分对丰度异常升高的OTU有显著的调节作用,琼玉膏对丰度异常下降和升高的OTU均有显著调节作用,表明两组分合用（琼玉膏）才能有效调节顺铂引起的OTU丰度异常。醇沉组分能显著富集Faecalibaculum、Bifidobacterium和 Lachnospiraceae NK4A136 group,上清组分能显著富集Akkermansia和Bifidobacterium,琼玉膏对以上菌属均有较好的富集作用,表明两组分合用（琼玉膏）才能达到更好地富集益生菌的效果。醇沉组分主要对血清和尿液的代谢轮廓的异常,血清中鞘脂代谢,尿液中嘌呤代谢、生物素代谢和酪氨酸代谢通路及其对应的代谢物Cer（d18:1/18:0）、IDP、Biotin和Norepinephrine的异常有显著调节调节作用;上清组分对血清和肾组织的代谢轮廓的异常,血清中鞘脂代谢,尿液中嘌呤代谢和生物素代谢通路及其对应的代谢物Cer（d18:1/18:0）、IDP和Biotin的异常有显著调节作用;琼玉膏对血清、尿液和肾组织代谢轮廓异常,以上所有代谢通路及色氨酸代谢通路,以上所有代谢物及Serotonin均有显著调节作用;表明两组分合用（琼玉膏）才具有同时调节血清、尿液和肾组织代谢异常的效果。琼玉膏及上清组分对顺铂引起的Indoxyl sulfate和p-Cresyl sulfate在肾组织中丰度的升高以及在尿液中丰度的降低有较好的调节作用,而醇沉组分效果不佳,表明醇沉上清组分对琼玉膏抑制Indoxyl sulfate和p-Cresy1 sulfate在肾组织中积累并促进其随尿液排出有主要贡献。琼玉膏及醇沉组分能显著增加粪便中乙酸和丁酸的含量,而上清组分效果不佳,表明醇沉组分对琼玉膏提高乙酸和丁酸水平的作用有主要贡献。结合组分表征和药效物质研究结果,琼玉膏醇沉组分和上清组分都具有减轻顺铂所致肾损伤的作用,可能与这两类组分分别含有具有肠道菌调节作用的多糖、寡糖及苷类成分有关。而琼玉膏及其两类组分的部分药效指标的差异性,可能与其各自糖苷键类型的不同及相对含量的差异,对不同的肠道菌群具有富集或抑制作用,形成了各自特定的肠道菌群结构和代谢轮廓,从而通过不同的通路发挥缓解顺铂致肾损伤的作用。醇沉部分（主要为多糖和寡糖组分）对琼玉膏发挥调节机体整体状态,抑制HDACs的表达和活性,提高肠道菌群多样性,富集益生菌Faecalibaculum丰度以及提高乙酸和丁酸含量的作用有主要贡献,可能与其中含有的大量多糖和寡糖类组分可能扶植了益生菌的生长并促进菌群的糖酵解有关。上清组分对琼玉膏发挥抗炎作用,富集Akkermansia丰度,抑制异丁酸、戊酸和异戊酸生成,减少肾组织中尿毒素的积累有主要贡献,可能与其中含有的苷类组分可能抑制了菌群的蛋白水解有关。综上,本研究证实了肠道菌群介导的琼玉膏减轻顺铂致肾损伤的作用,为在临床上推广应用琼玉膏治疗顺铂诱导的急性肾损伤提供科学依据,也为以肠道菌群为靶标治疗顺铂所致肾损伤提供实验依据。同时也揭示了醇沉组分和上清组分对琼玉膏缓解顺铂所致肾损伤的药效均有贡献,提示琼玉膏缓解顺铂致肾损伤的相关创新产品的开发中必须保留糖类组分,且在中药和方剂的制剂研发中,需要充分考虑糖类成分存在的价值,为基于琼玉膏的创新药物研发提供数据支持,也为其他经典名方的药效物质研究提供可参考的思路和方法。