由立枯丝核菌(Rhizoctonia Solani)引起的水稻纹枯病是世界性的水稻三大病害之一,几乎所有的稻田都会发生纹枯病,全世界平均每年因该病造成的损失稻谷达数十亿公斤。因此,对水稻纹枯病菌的研究具有非常重要的科学和实际意义。由于缺乏有效的遗传转化系统,对该病的研究主要集中在病菌的分类、抗性机制、病害流行与防治等研究。关于水稻纹枯病菌的遗传转化,国外已有了一些报道,国内则报道甚少。对于立枯丝核菌的转化效率,相关报道显示也是比较低,采用合适的启动子,是能否进行高效转化的关键因素之一,因此寻找水稻纹枯病菌高效启动子是提高其转化效率的一种途径。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GPD)在真核细胞中高效表达,如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)其含量可达细胞内可溶蛋白的5%；在面包酵母中其mRNA的量占总mRNA量的2-5%。因此,GPD基因的启动子可能为一强启动子。而且在许多不同的真菌中,GPD基因启动子已经被成功地用来构建转化体系。本研究利用同源克隆及染色体步移策略,从水稻纹枯病菌基因组获得4613bp片段,NCBI序列同源分析该片段包含了GPD基因,暂命名为vsGPD,预测其全长为1531bp。通过RT-PCR扩增其CDS序列,分析显示其拥有10个内含子。Southern杂交结果显示,vsGPD在水稻纹枯病菌基因组中以单拷贝形式存在。vsGPD编码343个氨基酸的蛋白。蛋白序列同源性分析,vsGPD基因氨基酸同源性与立枯丝核菌国际标准融合群AG-3最高,达85.52%。此外,在不同融合群的立枯丝核菌中内含子的分布及大小具有高度相似性。根据vsGPD基因设计引物,扩增水稻纹枯病菌的GPD启动子通过TFSEARCH软件对GPD启动子片段进行分析,结果表明此序列含有TATA-box、CAAT-box、G-box、SP1-box及CT rich-motif等顺式作用元件。采用PlantCARE数据库及TFSitescan service软件分析GPD启动子片段,结果表明,该片段含有多个转录因子如ADR1、GATA-box、CCAAT-box、StuA-type、GCR1及GCN4等结合位点。以pCAMBIA1300X质粒为骨架,构建3个以水稻纹枯病菌GPD启动子启动潮霉素抗性基因的表达载体,其中2个载体的潮霉素基因做了如下改进,通过Over-lap PCR将潮霉素基因的5’端的160bp-195bp区间的AT转变为GC或在潮霉素基因两端添加水稻纹枯病菌的漆酶(Z54277)内含子。利用上述质粒,进行农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝体及菌丝球。最终在农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝球中,获得了转化子。然而这些转化子在继代培养中,潮霉素抗性性状,出现了丢失的现象。表型分析表明,这些转化子为非整合转化(Transient transformation)即DNA未整合至染色体上,而是游离在基因组之外,因而在生长或继代的过程中丢失。此外,转化子获得数量偏低,表明该遗传转化体系有待进一步优化。